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鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VP2基因变异比较

朱瑞良  
【摘要】: 传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害雏鸡中枢免疫器官中的法氏囊为主要特征的传染病。1957年该病首次在美国特拉华州的甘布罗镇(Gumboro)的肉鸡群中发生。最初分离到的病毒发病率高,但致死率通常在2—5%,偶尔20—30%,这种病毒株称之为标准毒IBDV(vIBDV)。二十世纪80年代后期,美国出现了与标准毒在抗原性上有明显差异的变异株。欧洲国家首先报道了致死率高达90—100%的超强毒(vvIBDV),90年代初传至中国及亚洲其它地区。vvIBDV感染现已遍布于全球主要养禽地区,在工业化养鸡业发达的国家尤为严重,鸡群感染vvIBDV后,除直接引起死亡外,还可使雏鸡产生免疫抑制,导致机体的免疫防御能力降低和多种疫苗免疫失败,给养鸡业造成了巨大的经济损失。 随着分子病毒学技术的普及,包括中国在内的世界上许多国家不同实验室都对vIBDV、vvIBDV及变异株IBDV的VP2基因的高变区的核苷酸序列和氨基酸序列做了比较。最初发现所有的vvIBDV都有一些可能与致病性相关的氨基酸变异,但近年来也有学者认为,vvIBDV相关的VP2高变区的氨基酸有规律变异只是病毒演化过程中的一种普通的遗传标志,而不是与致病性相关的遗传标志。由此看来仅靠未经纯化克隆的由同种病毒不同亚群(quanspecies)组成的不同野毒株分离物的VP2基因的比较,无法回答这个问题。本课题试图将一个vvIBDV中国株在细胞培养上克隆化后,再返回SPF鸡连续传代,通过比较若干病毒克隆返鸡后不同代次的传代毒致病性与VP2基因变异,来从另一个角度验证VP2高变区变异是否与致病性有关。 在实施国家自然基金重大项目的过程中,本人所在实验室从全国30个省市已经收集了72株IBDV株,在对其中40株IBDV株进行毒力、血清学以及致病性检测的基础上,选择一个毒力最强的、致死率高达90%的vvIBDVGX8/99株作为本课题研究的起点。将vvIBDV GX8/99株通过传代,研究从原始毒(鸡源囊毒)→鸡胚毒→细胞适应毒→细胞克隆化毒→回传SPF鸡传代 b’扬州人学博十学位论文 毒(鸡源毒)个轮回过程中系列毒株致病性的变化规律及其与核普酸、氨 基酸变异之间的关系。初步掌握了vvIBDV在整个传代循环过程中的致病特 点,研究了vvIBDv从未经克隆的病毒的“群体致病性”到克隆化病毒的“个 体致病性”的变化规律。引进这一方法将有助于揭示vvIBDV的演变规律和毒 力改变的分子基础,有助十解决超强毒毒力如何增强?超强毒能否致弱?致 弱过程中核普酸和氨基酸序列发生了怎样的变化?这种变化与病毒生物学特 性有着怎样的关系?弱毒株的生物学特性如何等急需解决的问题。 本课题主要研究内容及其研究结果包括如下几个方面: 1.鸡传染性法氏囊病病毒超强毒GX8199株传代培养及病毒的克隆化:本研究 将vvIBDV Gx8/99株首先在SPF鸡胚上传10代,然后在鸡胚成纤维细胞 (CEF)上日传22代,开始适应CEF,并引起细胞病变(CPE),表现为细胞 聚缩、拉成纤丝状,最后变圆、脱落。再经无限稀释法进行2次病毒的克隆 化,筛选得到了4株克隆化病毒。以克隆化病毒为起点,再将这4株克隆化 病毒分别连续回归3一5周龄SPF鸡连传15代。各传代毒通过免疫胶体金试 纸膜检测,除CEF适应之前的细胞毒检测不到IBDV外,其余各传代毒均可 检测到IBDv。vvIBDV GX8/99株不同代次传代毒的获得,为研究该病毒从原 始毒(鸡源囊毒)一鸡胚毒一细胞适应毒一细胞克隆化毒~回传SPF鸡传代 毒(鸡源毒)一个轮回系列毒株致病性的变化规律及其与核营酸、氨基酸之 间的关系,更好地掌握vvIBDV在整个传代循环的过程中的致病特点,vvIBDV 从“群体致病性”到“个体致病性”的变化规律建立了新的技术平台。 2.鸡传染性法氏囊病病毒超强毒GX8/99株原始囊毒及其传代毒的致病性试 验:IBDV GXS/99株系1 999年从广一西一自然发病鸡群采集到的法氏囊组织 中分离到,经动物实验证明为超强毒。即用原始病鸡法氏囊悬液在SPF鸡 连续二二次人工感染后,再取法氏囊制备恳液分装在一700c保存,并用8日龄sPF 鸡胚经卵黄囊接种测定其鸡胚半数致死量(ELDS。)后,再经接种SPF鸡的致 病性试验表明,随鸡的l:1龄和接种剂量的不同,其致死率有很大差异。对28一30 日龄SPF鸡,病毒接种量为200个ELDS。时,感染后7日内死亡率高达60一90.5% (18/30和19/21);感染量为20个ELDS。日寸,死亡率亦可达53一92%(8/15不[] 23/25)。再用此vvIBov Gxs/99株的sPF鸡胚传代毒、4株克隆化细胞毒及 其分别连续回归3一5周龄SPF鸡的传代毒,进行了SPF鸡胚及SPF鸡的致 朱瑞良vvIBDV细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VPZ基因变异比较 病性试验,结果表明,对8日龄SPF鸡胚卵黄囊接种后,GXS/99株原始囊毒 在鸡胚中传代的过程中病毒滴度即ELDS。值在逐渐增大;但适应鸡胚的病毒 在适应细胞后,获得的4株在细胞培养上纯化的克隆化病毒,在重新接种鸡 胚时,病毒滴度却显著降低;然而,在再回传SPF鸡的过程中,其在鸡胚上 产生的病毒滴度即ELDS。值又逐渐升高。由此可见,鸡胚毒对SPF鸡胚的致 病性强,而细胞克隆化毒对鸡胚致病性弱,回传SPF鸡后又增强。各


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