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犬瘟热病毒中国分离株囊膜糖蛋白基因序列比较及其DNA疫苗的免疫效力

徐向明  
【摘要】: 犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)感染引起的急性、高度接触性传染病,是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疾病之一。虽然常规弱毒疫苗在控制CD的发生中起到非常重要的作用,但也存在难以克服的缺点。弱毒苗可引起免疫抑制和中枢神经系统的损坏;随着CDV宿主谱日趋扩大,弱毒疫苗的使用还可能致死某些易感动物并带来散毒的危险。此外,CDV本身的变异也可能导致疫病的流行。为了研制新一代安全、高效的CDV基因工程疫苗,本实验在对CDV致病性和免疫原性密切相关的F和H两个囊膜糖蛋白基因分子生物学特性初步探讨的基础上,以犬瘟热病毒中国分离株为素材,分别构建了表达这二个糖蛋白基因重组真核质粒pcDNA-F和pcDNA-H,并在小鼠和犬体内测定了它们的保护性免疫效力。现从四个方面概述如下: 一、犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白F和H基因的克隆与表达 将犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒以提取RNA作为模板,用RT-PCR扩增出融合蛋白(F)基因的两片个片段(覆盖其融合区、穿膜区和部分附膜区,长度分别为769bp和832bp)及附着蛋白(H)基因的5'端和3'端的两片段(长度分别为945bp、904bp)。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进原核表达载体pGEX-6p-1中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)下游,重组质粒转化宿主菌BL_(21)后,在37℃1.0mMIPTG 扬州大学博士学位论文 诱导下,F基因、H基因分段获得了良好表达,表达产物经聚丙烯酞胺 凝胶电泳鉴定,确定其表达的融合蛋白大小分别为54Kda、56Kda和 59Kda、58Kda。将表达产物回收后分别混合免疫小鼠,间接免疫荧光试 验显示免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应,两种基因产物混 合免疫小鼠后能激发出1:16的中和抗体。实验结果表明体外表达的犬 瘟热病毒囊膜糖蛋白基因保留了天然蛋白部分抗原性,有望以此为基础 研制亚单位疫苗,其抗体则可用于犬瘟热病毒相关研究的诊断。 二、犬瘟热病毒中国分离株囊膜糖蛋白基因的序列分析 以抽提的犬瘟热病毒中国分离株(CDv一YZ01OI,CDV一YZO102)基 因组RNA为模板,采用RT一PCR分别扩增出病毒1989bp的融合蛋白(F) 基因和1824bp的附着蛋白(H)基因,按常规方法克隆进pGEM一Teasy 载体,经蓝白斑筛选和酶切分析获取阳性重组质粒,进一步测定并分析 了F和H基因的序列。对于H基因而言,两种分离株核昔酸和编码氨基 酸的同源性达98%左右,与国内长春分离株也有约%%的同源性,但与 美国、日本分离株相比只有93一95%的同源性,然而,与两疫苗株 (Ondersteroop株,Convae株)则只有90一910,0的同源性。氨基酸分析显 示,中国分离株与其它分离株的H蛋白有8一9个潜在的天冬酞胺糖基化 位点。相比之下,OP一CDV疫苗株则只有4个这类位点。从系统发生上, CDv一YZo101、CDv一YZoloZ株与长春分离株同属一个系,不同于美国、 日本分离毒株,且野毒株与疫苗株相比,均存在着明显的差异。对F基 因而言,中国分离株间核昔酸和编码氨基酸同源性高达99%,与德国分 离株、海貂瘟热病毒11型(PDV一2)和疫苗株的核昔酸及编码氨基酸的 差异主要在于一个较长的信号肤区域,而编码的成熟蛋白(FO)表现出 较高的同源性,所有的13个半肤氨酸残基、4个潜在的天冬酞胺糖基化 位点和推测与融合功能密切相关的两疏水区域均完全一致。该结果不仅 证实了CDVF蛋白基因与H蛋白基因相比具有更高的同源性,且说明中 国分离株的有些基因已显示出与国外参考株不同的差异。本实验丰富了 犬瘟热病毒分子流行病学的资料,并为构建具有自主知识产权的基因工 程疫苗提供了条件。 徐向明:犬疽热病毒中国分离株遨膜精蛋白垂因序列分析及其DNA疫苗的免疫效力 三、犬瘟热病毒中国分离株囊膜糖蛋白基因免疫小鼠诱发的 抗体应答 经一系列步骤将CDV一YZO 101株的两囊膜糖蛋白基因定向导入真核 表达载体pcDNA3 .l(一)中,DNA测序和酶切分析筛选阳性重组质粒克隆 pcDNA一H和pcDNA一F,以重组质粒DNA和脂质体共转染COS一7细胞, 用间接免疫荧光试验证实转染的COS一7细胞的胞浆中分别表达了CDv 的H和F蛋白。 以聚乙烯胺(PEI)为佐剂,将犬瘟热病毒F和H基因重组质粒 pcDNA一H和pcDNA一F的DNA分别或混合肌注6周龄BABL/c小鼠,同 时设pcDNA原载体DNA对照。以2周为间隔共免疫4次,最后一次免 疫后3周采血分离血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒中和试验 (SN)分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答。结果显示:pcDNA一H 和pcDNA一F试验组免疫4次后分别激发T一02月3士o’64和1 02,9士0‘’34滴度 的ELIsA抗体,两种质粒DNA混合免疫后产生了1:32一1:128的CDV 中和抗体,而原载体DNA免疫后,用ELISA和SN未检测出特异的CDV 抗体。表明犬瘟热病毒囊膜糖蛋白基因的DNA免疫能诱发小鼠体内产生 特异性的体液免疫,这为进一步在CDV自然宿主犬体内的动物试验打下 了基础。 四、犬瘟热病毒囊膜糖蛋白基因和核蛋白基因免疫犬诱导 的保护性免疫反应 由于CDV核衣壳蛋白(N)在病毒感染早期可引起强烈的抗体反应, 且其上含有T淋巴细胞表位,在细胞免疫


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