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共表达禽流感病毒和鸡马立克氏病病毒或新城疫病毒主要保护性抗原基因的重组鸡痘病毒

陈素娟  
【摘要】: 鸡马立克氏病、新城疫、禽流感是严重威胁我国养禽业发展的三种主要传染病。免疫接种是预防这三种传染病的重要措施,为克服常规疫苗的不足,研制新一代安全高效、使用方便的基因工程疫苗,我们构建了共表达MDV gB基因和AIV HA基因的重组鸡痘病毒及共表达AIV HA基因和NDV F基因的重组鸡痘病毒,主要内容如下: 1、共表达MDV gB基因和AIV HA基因的重组鸡痘病毒的构建 强启动子PS插入含鸡痘病毒复制非必需片段7S中构建成重组质粒7SP;将鸡马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)基因和H_9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因插入至7SP通过酶切鉴定获得了PS-gB与P7.5-HA同向的转移质粒7SPGA,再将报告基因盒PL11-LacZ插入转移质粒7SPGA通过酶切鉴定获得7SPLGA;纯化后转染已感染鸡痘病毒282E4株鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-PS-gB-P7.5-HA,以间接免疫荧光法证实,gB基因和HA基因同时得到了表达。 2、共表达AIV HA基因和NDV F基因的重组鸡痘病毒的构建。 PUC18HA和SK质粒同时经HindⅢ、kpn Ⅰ酶切后连接得中间质粒SKHA;将质粒SKHA用BamHI酶切回收HA基因插入到插入载体pFGS11中的BamHI位点,通过酶切鉴定获得了pFGS11HA;将含NDV F基因的质粒PUC19F用HindⅢ、SalⅠ酶切经Klenow酶补平插入到经SmaⅠ酶切后的SKIFN中PE/L启动子下获得中间质粒SKF,再将质粒SKF和PUC18质粒先分别用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切Klenow补平,后再共同用SacⅠ酶切连接得PUC18PELF,SalⅠ酶切回收PE/L-F基因盒插入到pFGS11HA的SalⅠ位点,通过酶切鉴定获得了PE/L-F与PS-HA同向的表达载体pFGS11HAF。纯化后脂质体转染,蓝斑筛选纯化得到稳定的重组病毒rFPV-PS-HA-PE/L-F,间接免疫荧光法证实,HA基因和F基因同时得到了表达。 3、rFPV-PS-gB-P7.5-HA的初步免疫效力试验 以未完全纯化的重组鸡痘病毒1日龄免疫SPF鸡,并以常规疫苗作为对照, 陈索娟:共表达禽流感病毒和鸡马立克氏病病毒或新城疫病毒主要保护性抗原基因的重组鸡疫炳毒 结果表明lo6PFu rFPv一gB一HA针对表达MD的PI为53.8,针对Al的PI为69.5, 保护率均低于相应的单表达重组鸡痘病毒,证明该双表达重组鸡痘病毒能正确 表达MDV gB和AIV HA基因,并提供免疫保护作用。重组病毒未能完全纯化, 导致免疫保护率降低。 综上所述,本论文尝试了不同禽病的主要保护性抗原基因在鸡痘病毒载体 的联合表达,为探索基因工程联苗打下了基础。


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