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直接ELISA和PCR相结合快速检测样品中的沙门氏菌

黄金林  
【摘要】: 沙门氏菌是一种常见的重要人兽共患病原菌,不仅引起各种动物的沙门氏菌病,而且与人类多种疾病有关,其中,由沙门氏菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于首位或第二位。沙门氏菌在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫中均有重要的意义。 本研究首先根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物,建立了检测沙门氏菌的聚合酶链反应(PCR)技术。对沙门氏菌属A—F各群中共15株沙门氏菌标准菌株、27株沙门氏菌现场分离菌株和其他10株非沙门氏菌菌株进行PCR扩增,结果沙门氏菌均显示出495bp特异性DNA扩增条带,而所有对照均不出现特异条带,因此,此方法具有很强的沙门氏菌属特异性。PCR产物测序结果与已知序列一致,用测序产物作探针,通过斑点印迹实验(dot-blot)进一步验证PCR的特异性。PCR敏感性试验显示,该体系能检出14pg以上的沙门氏菌DNA;当沙门氏菌和大肠杆菌按不同比例混合后,直接ELISA方法和PCR方法的检测比较试验结果显示,在沙门氏菌:大肠杆菌为1:100时,用ELISA法和PCR法均能检测出阳性样品,在沙门氏菌:大肠杆菌为1:1000时,用ELISA法检测为阴性,而用PCR法则能检测出。通过对5种不同的DNA模板提取方法的比较,选定了操作简便、快速、费用低廉的热裂解法。 在沙门氏菌属特异性单抗试剂盒研究的基础上,将PCR法和单抗试剂盒两种快速检测方法进行了比较研究。两种方法同时应用于检测鲜牛奶、龙虾、虾仁、熟食制品等样品,并用国标方法对结果进行验证,结果表明两种方法的符合率可达97.6%;两种方法对冻虾仁、人粪便样品的前增菌、选择性增菌、后增菌过程进 黄金林ELISA法和PCR法相结合快速检侧沙门氏菌 行同步检测,在样品的前增菌液,直接ELISA法检测的OD。,,0.5,而PCR法扩 增能出现特异条带,经国标方法验证,为阳性,证实PCR法的敏感性优于直接ELISA 法,而在选择性增菌液和M一肉汤后增菌液中,两种方法均能检出阳性样品。 对城区141份水样进行直接ELISA法检测,阳性样品和随机挑选的部分EL工SA 结果阴性样品,进行PCR扩增,结果直接ELISA和PCR的符合率达97.2%。直接 ELISA法结合PCR方法对扬州市广陵区2002年春季饮食行业工作人员健康检查中, 共检测1426份人粪便样品,最终与常规国标方法对比,直接ELISA法的敏感性和 特异性达100%和97.2%,PCR法的敏感性和特异性均为100%。将两种方法结合使 用既可达到高度的敏感性和特异性,而且在短时间内(40小时内)得到结果。 通过对鲜牛奶样、龙虾、虾仁、熟食制品、水样、人粪样测试,最终确定较 优化的沙门氏菌检测程序,即:对大量样品采用直接ELISA筛检,除去大量阴性 样品,阳性样品采用PCR法作进一步鉴定;需要定型时则用国标方法。此法具有 高度的特异性、敏感性和快速简便等优点,且易于推广,为常年需处理大量样品 的防疫部门、动检、食品饲料监测等部门提供一种有效的检测手段。既可保证样 品检测的准确性和可靠性,又可节省大量的人力、物力和财力,有较大的社会经 济效益。


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