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两种来源青霉素酰化酶基因在大肠杆菌中克隆和表达研究

张爱晖  
【摘要】: 青霉素G酰化酶(pencillin G acylase,EC 3.5.1.11,简称PGA)能催化水解青霉素生成6-APA,还能催化青霉素扩环后的重排酸生成7-ADCA,6-APA和7-ADCA。(后者是合成半合成β-内酰胺抗生素的关键原材料);同时,PGA也能催化此二反应的逆反应,即催化β-内酰胺母核与其它酰基供体缩合产生一系列半合成β-内酰胺抗生素。因此PGA在β-内酰胺抗生素工业中扮演了极其重要的角色。许多细菌含有PGA基因,如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),粘节杆菌(Arthrobacter viscosus),嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Kluyvera cryocrescens),雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri),粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)。这些来源的PGA有着相似的蛋白结构,氨基酸序列的高度同源性显示它们可能由同一祖先衍变而来。虽然抗生素工业上主要采用E.coli来源的PGA,但是其他细菌来源的PGA具有其他不同性质,如B.megaterium来源PGA可以作用于不同种类头孢菌素,A.viscosus和B.megaterium来源PGA可以在Bacillus subtilis中表达并分泌至胞外,K.cryocrescens来源PGA对pH、温度、有机溶剂等的稳定性非常高。利用蛋白质工程手段改造P.rettgeri PGA,从而使其具有头孢菌素C酰化酶活性的工作也取得了一些进展。Chou等将雷氏普罗威登斯菌青霉素G酰化酶基因克隆到大肠杆菌中进行表达,酶活有大幅度提高。 本论文通过聚合酶链式反应(PCR)获得了E.coli PGA基因和P.rettgeri PGA(ATCC29944)基因。序列测定和计算机联配结果表明:E.coli FGA与Genebank AF237653一致;P.rettgeri PGA DNA序列与文献报道(ATCC31052)的同源性只有90.2%,所编码的氨基酸序列与文献报道同源性为92.8%,C端存在突变。将所得的两种来源PGA基因分别克隆至T71ac启动子控制下的表达载体pET24a中,构建了表达质粒pETePGA和pETrPGA,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),得到基因工程菌BL21(DE3)(pETePGA)和BL21(DE3)(pETrPGA)。对基因工程菌进行了发酵条件的优化,研究IPTG浓度、发酵温度和不同碳源对PGA基因表达的影响。在24℃、1.0mmol/L IPTG、5g/L甘油的条件下,可以高效表达。BL21(DE3)(pETePGA)和BL21(DE3)(pETrPGA)的表达量分别达到587.6U/L和993.4U/L。 张爱晖:两种来源青霉素酞化酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达 其中,BL21(DE3)(pETrpGA)的表达量比野生菌尸rovidencia rettgeri提高了65 倍。表达量超过了迄今文献报道的在大肠杆菌表达体系中的最高水平。对质粒稳 定性的研究表明,两种基因工程菌在无选择压条件下能够稳定传代到50代。这个 传代数己大大超过实际生产所需要的培养时间。这就为工业化生产打下了良好的 基础。


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