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表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

李军伟  
【摘要】:新城疫是由副粘病毒科的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种禽类烈性致死性传染病,是危害我国畜牧业的4大A类病之一,目前我国对该病的控制主要靠常规疫苗的免疫接种,但常规疫苗的免疫接种常常引起免疫失败,同时又干扰该病的流行病学监测,为了克服常规疫苗的这些缺点,在早期工作中,本实验室构建了表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒rFPV_(LP)-HN,经动物实验证实了该重组病毒免疫SPF鸡后能够完全抵抗NDV强毒的致死性攻击,然而免疫含有母源抗体的商品鸡商品鸡后只能提供部分免疫保护,基于此,本研究用毒力相对较强的鸡痘病毒FPV_(282E4)作亲本病毒,通过同源重组方法将HN基因插入FPV_(282E4)中,构建了能够正确表达HN基因的重组鸡痘病毒rFPV_(282E4)-HN,并对其遗传稳定性和免疫效力进行评估。 首先,从质粒GEMHN上切下完整的HN基因后,插入到质粒pFG1175-1的FPV基因组复制非必须区片段,使HN基因置于启动子P_(7.5)下游,获得转移载体pFGHN1175-1,用以转染预先感染FPV_(282E4)的CEF,经含有X-gal的营养琼脂覆盖后挑选蓝斑,多次克隆纯化后获得纯化的重组鸡痘病毒(rFPV_(282E4)-HN),以PCR方法确定HN基因成功插入到FPV_(282E4)内和间接免疫荧光试验证实了rFPV_(282E4)-HN能够正确表达HN蛋白。 将rFPV_(282E4)-HN在CEF上连续传20代后,用PCR方法扩增出原代、10代、20代的重组病毒的HN基因。测序结果发现10代和20代HN基因仅有1个碱基发生变异,氨基酸序列没有变异。应用转瓶分别培养了三个代次的重组病毒,结果显示各个代次的重组病毒的产量没有发生明显的变化,IFA证实了三个代次的重组病毒均能正确表达HN蛋白,进一步表明了rFPV_(282E4)-HN具有较好的遗传稳定性。 扬州大学硕士学位论文 10日龄sPF鸡随机分为四组,分别于颈部皮下接种rFPv282E4一HN(105PFu/ 羽)、rFPvLP一HN(一o5PFuz羽)、NDv油乳剂灭活苗(o.ZmF只)wt一FPv(lo5PFuz 羽)于免疫后7、12、16、21日龄分别采血;分离血清;作HI抗体检测,结果 发现:FPv282E4一HN和、rFPvLP一HN免疫组诱生的Hl抗体效价均低于ND油苗免 疫组的扭抗体效价,但免疫鸡均能够完全抵抗NDV强毒的致死性攻击。 用含有残余抗NDV母源抗体的30日龄商品蛋鸡进行免疫效力实验,结果 发现,由于母源抗体的干扰,rFPV282E4~HN和、:FPVLP~HN在商品鸡体内诱生的 Hl抗体效价明显低于ND油苗组的Hl抗体效价,免疫21天后用剂量为105EID刘 羽的NDV强毒滴鼻攻毒,结果发现wt一FPV免疫组和空白对照组的实验鸡全部 死亡,ND油苗、rFPV282E4-HN和rFPVLP~HN的免疫组的免疫保护率分别为100%、 80%、68%。对SPF鸡和商品鸡实验周期内的体重进行分析,结果表明两种不同 毒力的重组鸡痘病毒对SPF鸡和商品鸡的生长没有明显的影响 综上所述,表达NDVI硕N基因的重组鸡痘疫苗有良好的遗传稳定性,在SPF 鸡上能对NDV强毒的攻击提供100%的保护,但在商品鸡母源抗体的干扰仍是 一个巫待解决的问题。


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