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COS-1细胞SV40T抗原的RNAi研究及转基因动物模型的建立

梁权  
【摘要】:自从发现双链21碱基小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)可以引发特异性的基因沉寂,双链RNA(double—strand RNA,dsRNA)介导的RNA干涉(RNA interference,RNAi)已经逐渐在抑制基因表达方面得到了广泛的应用。目前广泛应用的体外合成RNA转染细胞的方法有合成成本高、转染效率低、不能持续发挥作用等缺点。构建siRNA表达载体,转染到细胞内转录后可形成大量的发卡结构的小RNA(short hairpin RNA,shRNA),而这些shRNA可特异地抑制基因的表达。 猿猴病毒SV40可引起生物形成多种肿瘤,其致瘤作用主要通过其早期区域基因编码产物大T抗原而实现。SV40T支持病毒的复制,可与众多肿瘤抑制蛋白如Rb和p53结合,使其丧失功能,致使细胞分裂加速,形成肿瘤。 本研究中,我们设计了针对病毒SV40T抗原编码区的三个不同位置处的21nt序列,并将已合成的三个序列插入到干涉表达载体,这种载体能产生针对SV40T抗原编码区的小干涉RNA。然后将能产生小干涉RNA的质粒瞬时转染COS-1细胞,通过半定量RT-PCR、间接免疫荧光、流式细胞仪、Western—blot等方法观测SV40T基因的抑制效果。实验结果表明,SV40T特异性小干涉RNA表达质粒转染的细胞无论从定性还是从定量上所测得的表达水平都明显低于阴性对照,这揭示了小干涉RNA确实能引起SV40T基因的沉默。因而这一结果为研究利用RNA干涉进行基因治疗提供了基础。 我们利用经过细胞转染验证有效的小干涉表达质粒经线性化后采用受精卵显微注射技术成功获得了转基因小鼠,此转基因小鼠模型可通过生殖器将目的基因稳定遗传给后代。通过对转基因小鼠后代的体内表达检测,证实目的基因在动物体内的大部分组织都有表达。此转基因小鼠模型的RNA干涉表达系统研究平台的成功建立,为进一步探讨SV40T的致瘤作用创造丁条件,为研究SV40T与其它相关基因的相互作用提供了前提和基础。


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