从cDNA克隆产生感染性ZJI株鹅源新城疫病毒

【摘要】：新城疫(ND)是由副粘病毒科、禽副粘病毒属(Avulavirus)中的新城疫病毒(NDV)引起多种禽类发生感染和高度死亡的一种急性、接触性传染病。强毒感染易感禽常呈败血症经过,传播迅速,常给养禽业造成重大经济损失。在国际动物卫生组织(OIE)的疾病分类中ND属A类病。水禽曾被认为对NDV有较强的抵抗力,感染后一般不会引起发病和死亡,但是,自1997年以来,我国很多地区鹅群中被相继报道感染NDV强毒,造成较为严重的发病和死亡,严重威胁着我国养鹅业及其他禽类养殖的发展,引起了众多业者的密切关注。系统阐明鹅群中NDV的来源、病原特性、遗传演化以及研制有效的新型疫苗来防制该病在鹅群中的继续感染和流行等研究工作迫在眉睫。近年基于病毒基因组cNDA克隆技术基础上发展起来的反向遗传技术己成为分子病毒学研究的一个重要工具。本实验室从发病鹅群中分离到数十株NDV强毒,并对其部分生物学特性进行了鉴定。同时,对其中的ZJI分离株进行了全基因组测序,首次研究发现该毒株的基因组核苷酸总数为15192bp而不是以往所报道的15186bp。在此基础上,本研究构建了含该毒株NP、P和L基因的表达载体并对P基因进行了融合表达鉴定:利用ZJI株NDV微型基因组对3个表达载体进行了功能鉴定:应用基因定点突变技术对该毒株全基因组cDNA克隆进行了定点突变:将基因组cDNA克隆和辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞继而接种SPF鸡胚后,拯救出了有感染性的ZJI株NDV强毒,并通过血凝(HA)和血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察和序列测定等方法对获救病毒进行了鉴定:同时,对获救病毒与野生型病毒进行了部分生物学特性比较,结果表明拯救出的NDV强毒株与野生型病毒具有相同的生物学特性。鹅源NDV强毒株的拯救成功为国内外首次报道,所建立的鹅源NDV反向遗传系统将成为NDV功能基因组研究和新型疫苗研制等研究中强有力的研究工具。 1.ZJI株鹅源NDV NP、P和L基因表达载体的构建及功能鉴定 根据已登录GenBank上的ZJI株NDV全基因组序列(登录号:AF431744)设计3对引物,以抽提的ZJI株NDV基因组RNA为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)