分子标记技术在甘蓝品种鉴定及未熟抽薹性状研究中的应用

【摘要】： 甘蓝起源于地中海沿岸,包括结球甘蓝、皱叶甘蓝、红甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝等多个变种,现已成为世界许多国家的主要蔬菜。目前,分子标记技术已广泛应用于多种作物研究,但在甘蓝上的应用研究刚刚起步,本课题以甘蓝为材料,研究其分子标记技术及其应用,主要开展以下三部分工作:第一部分是以结球甘蓝基因组DNA为模板,优化获得适用于八种甘蓝类蔬菜的RAPD、SRAP、ISSR技术体系;第二部分是利用SSR、RAPD技术鉴定甘蓝杂交种“早夏16”、“夏光”的纯度,利用SRAP、RAPD技术鉴定甘蓝杂交种“争春”、“寒光2号”的纯度,并建立相应的指纹图谱;第三部分是应用BSA方法研究春结球甘蓝未熟抽薹性状,寻找与春甘蓝未熟抽薹基因连锁的RAPD标记。主要结论如下: 1.甘蓝RAPD、SRAP、ISSR技术体系的优化和初步应用 优化得到反应总体积为20μl的甘蓝RAPD体系是:25 mmol/L MgCl2 2.0μl +10×PCR Buffer 2.0μl + 10 mmol/L dNTP 0.5μl + 5 U/μl Taq E 0.5μl + 20ng/μl Primer 1.5μl + 10ng/μl模板DNA 3μl +灭菌双蒸水10.5μl。适宜的RAPD扩增程序为:94℃5 min;94℃1 min,37℃1 min,72℃1.5 min(40 cycles);72℃10 min。优化得到反应总体积为20μl的SRAP反应体系是:25 mmol/L MgCl2 2.0μl +10×PCR Buffer 2.0μl +10 mmol/l dNTP 0.4μl +5 U/μl Taq E 0.2μl + 30 ng正向Primer + 30ng反向Primer + 25 ng模板DNA,其余体积以灭菌双蒸水补齐。适宜的SRAP扩增的程序为:94℃5min;94℃1min,35℃1min,72℃1.5min (5 cycles);94℃1min,48℃1min,72℃1.5min (35 cycles);72℃10min。 优化得到反应总体积为20μl的ISSR反应体系是:25 mmol/L MgCl2 1.8μl +10×PCR Buffer 2.0μl +10 mmol/L dNTP 0.4μl + 5 U/μl Taq E 0.3μl + 30ng Primer + 30 ng模板DNA,其余体积以灭菌双蒸水补齐。适宜的ISSR扩增程序为:94℃5min;94℃1min,50℃1min,72℃1.5min (40 cycles);72℃10min。 经优化的RAPD、SRAP、ISSR反应体系和扩增程序对八种甘蓝类蔬菜均适用,并且可分别利用RAPD引物S18、SRAP引物组合M3-E5和M4-E5、ISSR引物844将八种甘蓝类蔬菜一一区分。 2.分子标记方法鉴定甘蓝杂交种纯度 以“夏光”、“早夏16”、“争春”、“寒光2号”四杂交种及其各自亲本的基因组DNA为模板组合,通过RAPD方法成功筛选出能鉴定各杂交种纯度的引物,其中能鉴定杂交种夏光的引物为S15、S42和S147,能鉴定杂交种早夏16的引物为S42、S78和S88,能鉴定杂交种争春的引物为S42、S103和S193,能鉴定杂交种寒光的引物为S42、S89、S151,并将引物S42对四组材料扩增出的特异的RAPD指纹图谱转变为相应的数字指纹。 3.春结球甘蓝未熟抽薹性状RAPD分子标记研究 经260个RAPD引物筛选,获得4个能扩增出甘蓝未熟抽薹基因连锁标记的候选引物,4个引物对F2代分离群体扩增产生5个连锁标记,单个标记的连锁距离不同,其中最近达8.58cM。选择遗传距离较近的三个标记进行测序,根据三标记的大小和引物来源将其分别命名为S97-392、U16-446和U16-562。对三序列进行比较分析发现,三者之间不存在较大的相似性,且在GeneBank中未搜索到序列相同的DNA片段或基因。