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巴斯德毕赤酵母表达人组织激肽释放酶(hKLK1)的研究

姚黎平  
【摘要】: 人组织激肽释放酶(hKLK1)是一组紧密相关的丝氨酸蛋白酶亚家族中的一员,能够特异性的剪切肽前体,释放有生物学活性的肽分子。hKLK1的一个最显著的功能是能将其底物激肽原切割而释放出一种有效的血管舒张物质激肽,从而发挥调节局部血液循环以及肾脏的水和电解质平衡等功能。近来的研究显示,激肽释放酶-激肽系统与人和动物的高血压有关。 最近用甲醇营养型酵母Pichia Pastoris作为重组蛋白表达系统正变得越来越普及。P.Pastoris比哺乳动物细胞更容易进行基因操作及培养,并能生长至很高的细胞密度。同样重要的是,P.Pastoris是一种真核生物,因此具有蛋白质翻译后修饰功能,使得重组蛋白以可溶型方式表达和正确的方式进行折叠。另外,线性化的质粒DNA能通过同源重组的方式高效率插入酵母基因组,产生稳定的多拷贝整合表达载体的细胞系,加之表达载体中的强启动子,可驱动外源目的基因的高效表达。 本研究通过将人组织激肽释放酶(hKLK1)原编码序列克隆入Pichia Pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得pPIC9K-KLK1表达载体。分别用SalⅠ及BglⅡ酶切线性化后电转化GS115酵母菌株,经MD平板后在含不同抗性浓度的G418YPD平板上培养,筛选获得抗3mg/mlG418 Mut+型分泌表达hKLK1的重组酵母菌3株,抗1mg/mlG418 Muts型分泌表达hKLK1的酵母菌2株。通过Western-blotting证明,表达的重组hKLK1分子量正确,酶活性约为4.2U/ml。在此基础上,以初次转化和筛选的重组酵母菌制备感受态细胞,用同样的线性化重组质粒进行二次电转化,并筛选获得了表达水平更高的重组酵母菌。在摇瓶培养


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