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黄芩和石菖蒲及其成分的安胎作用及机理研究

姜国均  
【摘要】: 流产的原因及机理非常复杂,目前国内外大多数学者认为早期胚胎丢失与母胎界面的免疫状态和激素水平有很大关系。1953年,Medawar提出“胎儿同种移植”的概念来解释妊娠中母体与胎儿间的免疫相互关系,后来Wegmann等进一步提出了Th2细胞应答模式。越来越多的证据表明,母胎界面存在复杂的免疫调控和内分泌激素作用网络,并且妊娠时母体出现独特的免疫调节规律,各种相关因素互相作用,构成复杂的免疫平衡网络,任一因素失衡都可能导致胚胎丢失、妊娠失败。中药安胎已应用了上千年,但安胎机理尚不完全清楚,已有的研究多侧重传统中药复方的机理,而对发挥安胎作用有效成分的确定及其机理的研究甚少,另外,中药复方成份复杂,没有统一的国家(国际)标准,是中药难以推向世界的重要原因之一。 本研究依据中药传统理论,结合现代中药药理学,筛选出黄芩、石菖蒲等的有效成分黄芩苷、黄芩素、槲皮素和乙酸龙脑酯用于安胎试验。于妊娠的第4、5、6、7d,每只小鼠每天分别灌服中药黄芩、石菖蒲及其单体成分各0.4mL,受孕第7d用细菌脂多糖(LPS)或米非司酮(RU486)诱导小鼠流产,同时设P(progesterone,孕酮)、PXF(pentoxifylline,己酮可可碱)保胎对照组及PBS正常对照组,所有试验鼠均于受孕第9d眼球摘除放血,制成血清,颈椎脱臼处死。然后,剖开腹腔观察子宫和胚胎生长情况,记录胚胎着床数和死胚数;取左侧子宫用光镜、透射电镜观察组织学及超微结构变化,免疫组化检测子宫内膜CD4+和CD8+T淋巴细胞的分布和含量,探讨子宫组织局部变化与妊娠的关系;取右侧子宫制成子宫组织匀浆,用酶联免疫吸附技术(ELISA)检测子宫组织和血清中P水平,分析中药有效成分对子宫组织中生殖激素的影响,研究中药有效成分通过内分泌调节胚胎着床的作用及机理;取子宫组织匀浆和血清用ELISA检测IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10的含量,探讨免疫与流产的关系,以及中药有效成分对Thl/Th2型细胞因子的影响;取脾脏,流式细胞仪检测CD80/CD86的含量,研究中药对CD80/CD86协同刺激分子表达量的影响,以及与母胎界面局部Thl/Th2型细胞因子的关系,期望通过中药成分干预CD80/CD86协同刺激信号,调整母胎界面局部Thl/Th2型细胞因子的平衡,形成维持正常妊娠所需的Th2型反应偏倚,诱导母胎免疫耐受,从而阐明中药调节胚胎着床的免疫学机制。结果表明: 1.用RU486和LPS诱导小鼠流产,随着药物浓度的增强,流产率和胚胎丢失率逐渐增高,使小鼠大部分发生流产,胚胎吸收率上升。受孕第7d皮下注射RU486 80μg、第9d剖检,确定为RU486流产模型的试验用药剂量和剖检时间;受孕第7d皮下注射LPS 0.10μg、第9d剖检,确定为LPS流产模型的试验用药剂量和剖检时间。 2.在受孕第4~7d使用黄芩苷、黄芩素和黄芩煎液预防,黄芩及成分对RU486的流产作用有良好的抑制效果,黄芩及其成分黄芩苷和黄芩素各组,流产率和胚胎吸收率显著低于RU486组(p0.05或p0.01),CD4+T淋巴细胞数量极显著低于RU486组(p0.01),CD8+ T淋巴细胞数量与RU486组相近(p0.05)。RU486诱导流产小鼠子宫组织的炎性症状明显,滞后于胚胎发育;超微结构病理变化显著,线粒体变性,溶酶体增多,无分泌颗粒。黄芩及成分各组与RU486组相比,子宫组织学和超微结构损伤轻微,脾脏中CD80表达量有下降趋势,显著低于RU486组(p0.05);CD86表达量有上升趋势,显著高于RU486组(p0.05或p0.01)。RU486组子宫组织中游离孕酮含量升高,IL-2含量降低,IFN-γ浓度升高,IL-4、IL-10含量低于正常水平;黄芩苷、黄芩素和黄芩煎液组子宫组织中IL-4、IL-10含量显著高于RU486组(p0.05)。 3.在受孕第4~7d使用黄芩苷、黄芩素和黄芩煎液预防,黄芩及成分对LPS诱导的流产有良好的抑制作用,黄芩及成分各组小鼠子宫组织学和超微结构损伤较LPS组轻微,小鼠的流产率由100.0%分别降为33.3%、37.5%和40.0%,胚胎吸收率由100.0%分别降为29.4%、33.3%和31.6%。小鼠子宫IL-2的含量各组相近(p0.05)。子宫组织中IFN-γ含量,细菌脂多糖组高于其它各组(p0.01或p0.05);细菌脂多糖组、PXF组子宫组织IL-4和IL-10含量与正常对照组相近。 4.在受孕第4~7d使用槲皮素、乙酸龙脑酯、槲皮素+乙酸龙脑酯药液和石菖蒲煎剂预防,石菖蒲及成分对LPS的流产作用有良好的抑制效果,小鼠的流产率由100.0%分别降为50.0%、60.0%、30.0%和40.0%,胚胎吸收率由100.0%分别降为53.2%、60.4%、28.6%和36.7%。试验中Th1/Th2细胞因子含量与胚胎吸收率关系密切,槲皮素+乙酸龙脑酯、石菖蒲煎剂组中IFN-γ含量与正常对照组相近(p0.05),且极显著低于细菌脂多糖组(p0.01);槲皮素药液组中IFN-γ含量低于细菌脂多糖组,高于正常对照组,差异显著(p0.05);细菌脂多糖组的子宫组织中IFN-γ含量最高,流产率、胚胎吸收率最高。 通过对试验结果分析,可以得出以下结论: 1.RU486是一种P4的受体拮抗剂,且能诱使机体Th1/Th2平衡偏向Th1型反应,导致免疫排斥而诱发小鼠胚胎吸收、流产,对生产中常见的内分泌失调、免疫失调等造成的妊娠失败而言,是良好的实验模型。LPS可以诱导子宫产生炎症变化,改变母体正常的Th1/Th2免疫的平衡,使子宫局部免疫平衡偏向不利于妊娠维持的Th1型优势,导致免疫排斥而诱发小鼠胚胎吸收、流产,对生产中常见的感染性疾病、免疫因素等造成的妊娠失败而言,是良好的实验模型。 2.在受孕第4~7d使用黄芩苷、黄芩素和黄芩煎液预防,黄芩及成分黄芩苷和黄芩素对RU486、LPS的流产作用有良好的抑制效果,其安胎机理主要是:一方面黄芩及单体成分具有抗炎、抗病毒、抗氧化清除氧自由基,拮抗LPS诱导子宫内膜产生的炎症反应;另一方面黄芩及单体成分通过影响抗原呈递细胞表面共刺激分子CD80/CD86的表达,影响子宫内膜CD4+和CD8+ T淋巴细胞的分布和含量,影响子宫局部孕激素的含量变化,从而调整母-胎界面局部Thl/Th2型细胞因子的平衡,形成维持正常妊娠所需的Th2型反应偏倚,表明中药可能通过免疫调控和内分泌激素作用网络,使Th1/Th2型细胞因子保持动态平衡,恢复各生殖激素的动态平衡,恢复正常的妊娠微环境而起到安胎作用。 3.在受孕第4~7d使用石菖蒲及成分槲皮素和乙酸龙脑酯煎液预防,石菖蒲及成分槲皮素和乙酸龙脑酯对LPS的流产作用有良好的抑制效果,其安胎机理主要与石菖蒲及单体成分具有镇静安神、具有抗炎、抗过敏、抗氧化等多种生物学效应有关。另外,石菖蒲及成分可能还通过调整母-胎界面局部Thl/Th2型细胞因子的平衡,形成维持正常妊娠所需的Th2型反应偏倚。表明中药可能通过调节机体神经功能和免疫功能的状态,恢复正常的妊娠微环境而起到安胎作用。


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