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猪圆环病毒衣壳蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

陈长春  
【摘要】: 猪圆环病毒(Porcine circovirus)属于圆环病毒科,圆环病毒属。病毒分为PCV1和PCV2两种,其中PCV1无致病性,PCV2对猪具有致病性,可导致断奶仔猪发热、生长不良、呼吸障碍、母猪流产等临床症状,而且可引起免疫抑制,容易继发或并发其他疾病,给世界养猪业造成了非常大的经济损失。为进一步研究PCV(尤其是PCV2)在我国的流行性,本研究针对PCV衣壳蛋白进行了以下研究: 根据GenBank中已发表的Ⅰ型猪圆环病毒(PCV1 U49186株)、Ⅱ型猪圆环病毒(PCV2 DQ104422株)全基因组序列,各设计一对引物,以JS分离株病毒为材料,用PCR分别扩增出病毒衣壳蛋白PCV1-Cap、PCV2-Cap编码基因片段,扩增的DNA片段大小约为579bp,与预期大小相同。将扩增的PCV1-Cap、PCV2-Cap基因片段分别克隆到pGEM-T Easy载体中,经酶切鉴定证实为目的基因。再将克隆后的PCV1-Cap、PCV2-Cap基因片段分别定向克隆入pGEX-6P-1质粒载体,获得重组质粒pGEX-PCV1和pGEX-PCV2。重组菌裂解物的SDS-PAGE分析证明,含有重组质粒pGEX-PCV1或含有重组质粒pGEX-PCV2的大肠杆菌BL21均分别能够表达分子量约为48ku的融合蛋白,从而为研制PCV单克隆抗体提供了抗原。 利用提取研究一中制备的融合蛋白GST-PCV2为抗原免疫BALB/c小鼠(免疫时间分别为8周龄、10周龄、12周龄)。最后一次免疫3天后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按照常规杂交瘤技术融合,经间接ELISA筛选获得两株能分泌特异单抗的杂交瘤细胞株。分别命名为M1和G1。M1株能分泌针对PCV2的单抗,G1株能分泌同时针对PCV1和PCV2的单抗。并利用该单抗初步建立了间接ELISA、Dot-ELISA和间接免疫荧光(IFA)等特异性检测PCV2和PCV抗原的方法。为进一步建立特异性强、敏感性高、简便快速的PCV2和PCV检测方法打下了基础。


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