E6-GST融合蛋白表达及HPV16 E6单克隆抗体制备

【摘要】： 人乳头瘤病毒(HPV Human papillomavirus)是一组具有组织特异性的双链DNA病毒。研究发现,高危型HPV感染是宫颈癌发生发展的必要因素,特别是HPV16型在宫颈癌组织中检出率可高达50%。HPV感染性疾病、宫颈癌已严重威胁了广大妇女的生殖健康,现今条件下仍无特效的预防和治疗方法。 乳头瘤病毒基因组至少有10个开放阅读框架(Open reading fame, ORF),主要位于同一条DNA链上,而另一条DNA链仅含少量的ORFs,被认为是非编码性的DNA链。各种HPV基因结构大致相似,由早期(E)编码区、晚期(L)编码区以及介于E6和L1之间0.4 kb~1.01 kb的非编码区3个部分组成。 本研究根据已发表的HPV16全基因组序列,设计并合成一对针对HPV16E6/7基因序列的特异性引物,以含HPV16E6/7蛋白基因的转基因小鼠的癌组织DNA为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增HPV16E6/7基因序列,其大小为780 bp。 将PCR产物克隆入pGEM-T载体,构建了重组质粒pGEM-T-E6/7,经EcoRI和XhoI限制性内切酶双酶切,回收目的片段,并克隆到PGEX-6P-1表达载体。通过PCR、酶切及测序鉴定证实,HPV16E6/7基因以正确的阅读框架插入到PGEX-6P-1载体中。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,运用SDS-PAGE电泳分析表达产物,并用Western Blot进行鉴定,HPV16E6重组蛋白的相对分子质量约为4.3×104。利用亲和层析法从表达产物中纯化出目的蛋白。 以纯化的HPV16E6重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并采用间接ELISA法进行筛选,共获得了4株能稳定分泌针对HPV16E6蛋白的特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B11E1E8D4、5C2A4D6E8、4B12C5C8F7、2E3F9C4C6,抗体亚型检测结果分别为IgG1、IgG2b、IgG1及IgG2a。利用间接ELISA、免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定,证实这4株单克隆抗体均能与重组HPV16E6蛋白发生特异性反应,其中5C2A4D6E8、4B12C5C8F7、2E3F9C4C6三株属于相同的抗原表位,而4B11E1E8D4属于不同抗原识别位点。本研究通过GST融合蛋白成功制备出针对人乳头瘤病毒16E6蛋白的特异性单克隆抗体,为今后进一步探索其生物学功能、HPV16E6的检测以及免疫学治疗奠定了基础。