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犬瘟热病毒的分离及单克隆抗体的研制

时红星  
【摘要】: 犬瘟热(CD)是一种由犬瘟热病毒(CDV)引起的犬急性传染病。CDV属于副粘病毒科的麻疹病毒属。主要引起犬科、鼬科和浣熊科动物犬瘟热的发生,大熊猫和小熊猫等我国珍稀野生动物也不能幸免。但是伴随生态环境的变化和CDV对动物流行病因素的适应,它的自然感染宿主范围在不断扩大。 一、表达犬CD150的Vero细胞系的建立及犬瘟热病毒的分离 犬瘟热病毒的分离和培养是确诊犬瘟热的最根本方法,选择适合的细胞是分离和培养的关键。目前,在用Vero细胞系进行CDV分离和培养时,需要传代数次或添加胰酶,才有可能产生细胞病变,而有些CDV毒株经处理后仍不能产生细胞病变,这样就给CDV的研究带来不便。有报道称,淋巴细胞活化信号分子(SLAM,CD150)是CDV等病毒的受体。本研究通过PCR技术扩增犬白细胞中的CD150基因,构建真核表达载体pIRES-CD150,转染Vero细胞,利用G418进行筛选,挑取单个细胞克隆进行培养,建立了Vero-CD150细胞系。通过PCR技术和流式细胞术对Vero-CD150细胞系进行鉴定,同时检测该细胞系的遗传稳定性和培养特性,发现该细胞系培养方法与Vero细胞相似,且多次传代复苏后,仍能稳定表达CD150基因。利用Vero-CD150细胞系分离CDV,出现明显的细胞病变,且通过RT-PCR技术扩增出病毒的特异性片段,将分离到的一株CDV命名为CDV0701株。 二、犬瘟热病毒H、F基因的原核表达及单克隆抗体的制备 利用PCR技术,扩增出CDV0701株血凝素蛋白(H)基因以及融合蛋白(F)基因,将H基因和F基因分别插入原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pGEX-H和pGEX-F。通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析表明,重组菌能正确表达GST-H和GST-F融合蛋白。 分别以纯化的融合蛋白GST-H和GST-F免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。获得2株针对CDV H蛋白的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为4A10和2D5,其腹水型效价分别为2.56×10~4、2.56×10~4;获得3株针对CDV F蛋白的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为3E10、5F9和1G2,其腹水型效价分别为1.28×10~4、1.28×10~4、2.56×10~4。ELISA和Western-blot分析结果显示,以上5株单抗仅与对应的蛋白质反应,而与原核表达载体pGEX-6P-1蛋白不反应。间接免疫荧光试验显示,5株单抗均能与感染了CDV0701株的Vero-CD150细胞发生反应。这5株单抗的获得为进一步研究CDV H蛋白和F蛋白的功能,及建立检测CDV的方法提供了工具。


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