鹅PIT-1基因的克隆、表达和遗传效应研究

【摘要】： 垂体特异性转录因子(Pit-1)由PIT-1基因编码,是动物垂体前叶特异表达的一种具有重要功能的转录因子。PIT-1与垂体中PRL、GH、TSH-β以及自身的启动子结合,调控这些基因的转录,通过调节这些基因的表达而在机体的生长、发育、繁殖和免疫等很多方面起着重要作用。 本文对鹅PIT-1基因进行了系统的研究,以狮头鹅、皖西白鹅和籽鹅为对象,首次获得了PIT-1基因的cDNA序列,对其编码区及氨基酸序列进行了生物信息学分析;检测了狮头鹅、皖西白鹅、籽鹅、浙东白鹅、四季鹅和朗德鹅群体PIT-1基因序列的遗传变异,比较不同群体内的基因型的分布规律,并分析了基因遗传变异对早期体重和屠宰性状的影响;同时采用荧光定量PCR技术首次分析了皖西白鹅PIT-1基因早期的发育性表达规律,分析了GH基因和PRL基因的表达模式,并首次对不同基因间表达规律的关系进行了初探。主要研究结果如下: 1.以皖西白鹅、籽鹅和狮头鹅为研究对象,采用RT - PCR和克隆测序的方法,获得了鹅PIT-1基因2条长为1014 bp的cDNA序列以及内含子2和2a的全部序列;其中编码区长度为1011 bp,与人类、鼠、火鸡、鸡和鸭的同源性分别为63.2%、68.2%、83.5%、84.3%和97.2%;内含子2和内含子2a的长度分别为819 bp和333 bp,与鸭的内含子序列的同源性分别为83%和89.2%;2条编码区序列分别在485位和746位存在差异。 2.采用生物信息学方法分析得到的编码区序列, 2条序列的差异引起了其编码氨基酸162位和250位的变化,氨基酸序列与火鸡、鸡和鸭的同源性较高。所编码的氨基酸序列有15个磷酸化位点,且大多为亲水性氨基酸,无跨膜螺旋结构;氨基酸序列的二级结构包含了alpha螺旋(154AA)、延伸片段(16AA)和随机螺旋(166AA)三种结构,具有POU蛋白家族特有的保守结构,确定为鹅Pit-1氨基酸序列。 3.在鹅PIT-1基因内含子1内检测到2处插入/缺失变异,该变异的分布在不同群体内差异显著,在外来品种朗德鹅内表现为单态;统计结果显示该遗传变异与皖西白鹅早期体重显著相关,插入了片段的B等位基因有利于早期体重的增加,可作为辅助分子标记对鹅早期体重性状进行选育;同时该遗传变异与狮头鹅的屠体性状有显著的基因型效应,AB型的心率显著高于AA型。表明对不同类型群体而言,该变异所影响的性状可能不一致。采用PCR-SSCP技术在6个群体内检测到了3个SNPs,其中非编码区以及364位的变异只存在于朗德鹅群体内;基因型在群体内的分布差异极显著,EE基因型只存在于朗德鹅群体内;统计结果显示,狮头鹅、籽鹅群体内DD型早期体重显著高于CD型,浙东白鹅群体内CD型体重显著高于CC型,表明D等位基因对于体重而言可能为有利基因;狮头鹅群体内的DD型腹脂率显著高于CD型,与体重的基因型效应一致,而籽鹅群体内DD型屠体率高于CD型,但差异不显著,CC型屠体率显著高于CD,说明就不同类型的群体而言,基因型对性状的影响可能会存在差异。在检测到的2种遗传变异的分布上,朗德鹅与国内5个群体存在极显著的差异,在这2种变异上所有个体表现为单态,这可能与群体的不同起源有关,也可能与群体长期适应不同生产性能的选育有关。插入/缺失变异的AA基因型和SNPs变异的EE基因型可能更利于朗德鹅的肥肝性能,可作为其选育的辅助分子标记。 4.采用荧光定量PCR技术检测PIT-1基因、GH基因和PRL基因的早期发育性表达模式,结果表明,公母之间垂体内PIT-1基因和GH基因在0 - 4周龄内的变化趋势存在差异,其余阶段变化趋势一致;公母之间下丘脑内GH基因的表达出现高峰和低谷的阶段不一致,其余大体相同,表明PIT-1基因和GH基因的表达在性别间表现出二态性,对不同性别性状的影响可能会不一致。同一性别内,GH基因在公鹅垂体内和下丘脑内的表达模式一致,而母鹅在0 - 2周龄及30周龄的变化存在差异;表明不同性别间GH基因表达受调控的机制可能会存在一些差别。母鹅PRL基因不同组织内表达的模式不一致,垂体和下丘脑在2 - 10周龄内变化趋势一致,而在15周龄前,卵巢与下丘脑的变化趋势相反,说明对PRL基因而言,不同组织内基因的表达可能因不同因素的调节而存在差异。对PIT-1、GH和PRL 3种基因垂体内的表达模式进行比较发现,无论公母,垂体内GH基因的表达模式与PIT-1基因完全相同,说明GH基因的表达随着PIT-1基因的表达变化而变化,受到PIT-1基因的遗传调控;而PRL基因的表达模式和PIT-1基因并不完全一致,暗示PRL基因的表达还可能受到PIT-1基因与其它因子的共同影响。这一结果与前人的相关报道一致。