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宫颈癌Hela细胞中miR-21与PDCD4相互作用的研究

戴桂红  
【摘要】: 目的: 应用生物信息学方法和分子生物学技术,在宫颈癌Hela细胞中预测并验证miR-21的相关靶基因,探讨miR-21与靶基因的相互作用及其与宫颈癌发病的关系,为进一步研究宫颈癌发生的分子机制和宫颈癌基因治疗方法提供新的思路和实验依据。 方法: 1、应用生物信息学方法分析miR-21的染色体定位、保守性分析等,利用网络共享软件MicroCosm Targets、TargetScan和PicTar,分析其可能作用的靶基因。 2、用脂质体转染的方法,将美国Ambion公司合成的pre-miR-21、pre-miR negative control和anti-miR-21、anti-miR negative control瞬时转染入Hela细胞中,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测miR-21相对表达量。 3、蛋白免疫印迹方法(Western-blot):提取细胞总蛋白,经电泳、转膜、PDCD4抗体孵育,曝片显影,利用软件对PDCD4蛋白的相对含量进行分析。 4、荧光素酶报告实验:将PDCD4分子的3’UTR序列中miR-21结合位点上下游的部分片段导入pMIR-REPORT-luciferace荧光素酶报告基因载体,构建重组载体(pMIR-Luc-PDCD4),并进行酶切及测序鉴定。以重组载体(pMIR-Luc-PDCD4)、标准化对照载体(pMIR-REPORT-β-gal)与pre-miR-21或anti-miR-21共转染Hela细胞(实验组),72小时后分别检测Hela细胞的荧光素酶(Luc)和β半乳糖苷酶的活性,计算二者的比值(Luc/β-gal)。同时设立三个对照组(no miRNA空白对照组、pre-miR-negative对照组和anti-miR-negative对照组),比较各组Luc/β-gal比值,验证miR-21作用靶点的真实性。 结果: 1、利用在线软件PicTar、MicroCosm Targets和TargetScan预测miR-21的作用靶基因。结果发现PDCD4可能是miR-21作用的靶基因。 2、Western blot结果发现,转染pre-miR-21后,细胞中PDCD4蛋白的表达水平下调(P0.01);转染anti-miR-21后,细胞中PDCD4蛋白的表达水平上调(P0.05)。 3、利用pMIR-REPORT荧光素酶报告基因载体,经酶切鉴定和测序验证,成功构建重组载体pMIR-Luc-PDCD4-3’UTR。pMIR-REPORT荧光素酶实验结果表明,三个对照组(no miRNA空白对照组、pre-miR-negative对照组和anti-miR-negative对照组), Luc/β-gal比值接近。实验组,pre-miR-21共转染组,荧光素酶活性下降约43%(P0.001);anti-miR-21共转染组,荧光素酶活性升高约37%(P0.001),表明PDCD4是miR-21的真实作用靶点。 结论: 1、在宫颈癌Hela细胞中,miR-21调控抑癌基因PDCD4蛋白的表达,PDCD4是miR-21的重要靶基因。 2、miR-21在宫颈癌发病过程中可能起着一个原癌基因的作用,并可能成为宫颈癌基因治疗的有效靶点。


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