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乳杆菌胞壁蛋白酶分离纯化及特性研究

童敏  
【摘要】:一些乳杆菌菌株制作的发酵乳具有降高血压功能,主要是由于发酵过程中,乳杆菌的蛋白水解系统分解乳蛋白产生多肽,一些多肽对血管紧张素转移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme, ACE)具有抑制作用,从而达到了降低血压的效果。本文就所分离筛选的干酪乳杆菌胞壁蛋白酶的分离纯化,理化特性,以及在水解不同种类酪蛋白产生ACE抑制肽过程中的作用进行了研究。 通过对绍兴绿头鸭肠道内乳杆菌的筛选,分离出2株具有高产蛋白酶能力的乳杆菌,经生理生化试验,16SrRNA试验鉴定为干酪乳杆菌鼠李糖亚种和干酪乳杆菌干酪亚种。考虑到干酪乳杆菌干酪亚种产蛋白酶活性较高,于是选定干酪乳杆菌干酪亚种作为进一步研究对象,定名为Lactococcus casei DI-1。 采用Ca~(2+)-free法将干酪乳杆菌胞壁蛋白酶(Cell-Envelope-Proteinase,CEP)从细胞壁上解离下来。通过单因素试验和响应面设计对干酪乳杆菌胞壁蛋白酶提取条件,包括pH、温度和EDTA-Na2浓度对提取率的影响进行了研究,以CEP的活性为响应值,得到最佳提取条件为:温度39.75℃,pH6.98,EDTA-Na2浓度50.03mM。 为了进一步研究Lactococcus casei DI-1胞壁蛋白酶的理化特性,通过硫酸铵沉淀,DEAE-Sephadex A-25离子交换柱,Sephadex G-100凝胶柱层析,纯化了干酪乳杆菌的CEP。纯化后的CEP比酶活力为19.01 mg/mL,回收率为24.85%,提纯倍数为76.04。 纯化后的干酪乳杆菌CEP分子量约为35kDa,米氏常数(Km)为0.29mM,N端氨基酸序列为Asp-Asn-Asp-Phe-Glu-Ile-Phe-Glu-Ser-Ser-。以MeOsuc-Arg-Pro-Tyr- pNA (MS-Arg)作为专一底物,得到CEP的最适酶反应温度为37℃,最适酶反应pH为7.0。Mn~~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)、Co~(2+)和Fe~(3+)能够激活CEP的活性,K~+,Ca~(2+),Zn~(2+),Ni~(2+)和金属离子螯合剂EDTA可抑制CEP的活性,说明该酶的活性中心构象与金属离子有关。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对CEP有抑制作用,说明CEP为丝氨酸蛋白酶。 经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱分离,可将酪蛋白分为以下三个组分:第一组分是κ-酪蛋白,第二组分以α-,β-酪蛋白为主要成分,第三组分为β-酪蛋白。用未经纯化和纯化后的CEP分别水解三个组分以确定CEP产生ACE抑制肽的能力,纯化后的CEP均占未经纯化CEP产生ACE抑制能力的50%以上,进一步证实了CEP是水解乳蛋白产生ACE抑制肽的关键酶,且其他的蛋白酶在水解过程中起到协同作用。


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