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坛紫菜hsp70真核表达载体的构建及表达

仪茜茜  
【摘要】:紫菜是重要的经济海藻,广泛分布在我国沿海的潮间带,多变的生存环境使其对逆境胁迫有着特殊的适应性,尤其是对温度、渗透压和高辐射等逆境具有快速和高效的调节机制。深入研究紫菜抗逆相关基因及其功能对于我们了解生物抗逆机理具有重要帮助。 本研究坛紫菜hsp70为目的基因,基于真核表达质粒p181AINE,构建了坛紫菜hsp70真核表达载体p181-hsp70,经PCR扩增、酶切及测序等方法鉴定表明该真核表达载体构建成功。利用电激转化的方法将表达载体导入野生型酵母菌株BY4741和SSA3(诱导型hsp70)基因缺失型的酵母菌株YBL075c中,进行了表达。测定了重组酵母菌株的生长曲线,利用实时荧光定量PCR技术研究了重组野生(过量表达)型酵母(BY4741+p181-hsp70)和缺失补偿型酵母(YBL075c+p181-hsp70)两菌株当中的外源基因hsp70在短时热激下的相对表达情况,,并利用NMR技术进行重组酵母的代谢组学的初步研究。实验结果显示: 1、在30℃和40℃培养条件下,重组野生(过量表达)型酵母菌株(BY4741+p181-hsp70)、缺失补偿型酵母菌株(YBL075c+p181-hsp70)与其对照组菌株相比,生长状况均无明显差异;45℃培养条件下,缺失补偿型重组酵母与其对照组均不生长;转空质粒的野生型对照(BY4741+p181AINE)几乎不生长,而重组酵母BY4741+p181-hsp70生长状况明显好于该对照,但二者均不及在30℃和40℃条件下的生长状况。 2、以酵母18S rDNA为内源特异性参照基因,利用实时荧光定量PCR技术,对重组野生(过量表达)型酵母(BY4741+p181-hsp70)和缺失补偿型酵母两个菌株当中的外源基因hsp70在短时热激下的相对表达情况进行了研究。结果表明:两个类型的重组菌在热激5min时外源hsp70的表达量下降,15min时上升,30min时又略降低,外源基因表达的总趋势相似;而重组野生型酵母在热激5min时,hsp70表达量较少,仅为(相应)对照的0.75倍,缺失型重组酵母在热激15min时的表达量增加较多,达到(相应)对照的1.5倍。造成该现象的原因,推测重组质粒上启动子的类型与酵母SSA3中的热激调控元件(诱导元件)可能影响外源基因转录水平上的表达效率。 3、以NMR技术进行重组酵母的代谢组学分析,发现缺失补偿型酵母与其对照之间无明显差异,而重组野生型酵母的代谢组成分较对照组产生明显差异,但这些成分的具体归属及作用有待进一步分析。


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