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罗非鱼无乳链球菌的分离鉴定及其Sip免疫保护效果的研究

周清  
【摘要】:近年来我国中南地区暴发了多起水生动物流行性疾病,对当地养殖业造成了极大的经济损失。本实验从海南省患暴发性流行病的罗非鱼(Tilapia)上分离纯化1株细菌,对该菌株进行鉴定并开展致病性和药物敏感性研究。通过形态学、生理生化特性及16S rRNA鉴定,结果显示,该分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),命名为HNLFYL4。经人工感染试验证明HNLFYL4对小白鼠和罗非鱼均具有致病性,对6周龄小白鼠的LD50为1.0×104CFU/ml,对体重为500±20g罗非鱼的LD50为1.729×109CFU/ml。药物敏感性研究结果表明:HNLFYL4对氯霉素、青霉素G、呋喃妥因等敏感,对丁胺卡那、链霉素、卡那霉素等不敏感。 如何有效地防治无乳链球菌病的暴发和蔓延,成为了中南地区水产养殖业健康发展的关键。研究证实,无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenicprotein,Sip)作为抗原免疫小鼠,能提供良好的免疫保护效果。但有关Sip蛋白对无乳链球菌引起的水生动物是否具有保护作用,尚不清楚。因此,本研究使用表达的Sip重组蛋白制备抗原,免疫罗非鱼后研究其对无乳链球菌的免疫保护作用,为进一步研究开发无乳链球菌基因工程疫苗提供参考。 本实验利用PCR方法对无乳链球菌HNLFYL4株的Sip基因进行扩增,通过pET28a(+)载体构建HNLFYL4株Sip基因的表达载体pET28a-Sip,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约49KD相吻合的融合蛋白带,诱导4h后目的蛋白获得了高效表达。用罗非鱼为模型动物,腹腔注射不同剂量的重组表达的蛋白,用无乳链球菌HNLFYL4株攻毒检测其保护效率,其相对保护率分别为59.3%、70.3%、66.7%。这为无乳链球菌基因工程亚单位疫苗的开发奠定了基础。


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