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曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)精子发生相关驱动蛋白基因kifc1的表达及作用分析

马晓欣  
【摘要】:曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)是我国重要的经济头足类软体动物之一,近年来在浙江、福建等地增养殖开发获得成功。有关该物种的繁殖与发育生物学研究已受到重视,尤其是精子形成机制的研究倍受关注。本文采用基因克隆、原位杂交、显微及亚显微技术研究了曼氏无针乌贼kifc1基因序列、结构特点及组织表达特征以及kifc1基因在曼氏无针乌贼精子发生过程中的时空表达模式,探讨了kifc1基因在曼氏无针乌贼精子形成过程中的可能作用,为其精子形成分子机制的研究积累了基础资料。 1. kifc1基因序列、结构特点及组织表达特征本研究通过兼并PCR结合RACE的方法,从曼氏无针乌贼精巢中克隆到与大鼠及嘉庚蛸同源的KIFC1蛋白的类似基因kifc1。其cDNA全长为2432bp,包括ORF2109bp,可连续编码703个氨基酸。通过BLAST和不同物种KIFC1蛋白的多重序列比对发现,曼氏无针乌贼kifc1基因与嘉庚蛸kifc1基因的同源性最高;利用对该蛋白二级结构和三级结构的预测发现,曼氏无针乌贼KIFC1蛋白的马达结构域较为保守,包含ATP结合位点及微管结合位点,而N末端特异性较强,可结合不同的货物。中间的颈部连接头部和尾部,决定KIFC1蛋白的运动方向。通过RT-PCR的方法研究发现kifc1基因在曼氏无针乌贼精巢、肝脏、胃、肌肉、盲囊和鳃中均有表达,但其表达量在不同组织中有所差异。 2. kifc1基因在曼氏无针乌贼精子发生过程中的时空表达模式及作用本研究利用原位杂交技术对kifc1基因在曼氏无针乌贼精子发生过程中的表达情况进行检测发现:在精母细胞时期,细胞核呈不规则圆形,kifc1基因未见明显表达;早期精细胞,核呈圆形或卵圆形,核前端顶体囊开始形成,kifc1基因已有一定量的表达,mRNA信号主要定位于核周;中期精细胞,核拉伸呈长椭原形,顶体呈三角形囊状,kifc1基因的表达量达到了最高峰,mRNA信号围绕核周分布,并向顶体端聚集。后期精细胞,核进一步拉长呈稍弯曲的长纺锤形,顶体呈不规则四边形的囊状,mRNA信号聚集在核前端顶体囊区域。成熟精子,核呈前端稍弯曲的长纺锤形,顶体呈不规则四边形囊状,kifc1基因不再表达。通过以上研究结果,本文得出如下结论:kifc1基因表达的蛋白可能在精细胞核形变过程中发挥作用,也可能参与顶体的生物发生。


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