人咽缩肌细胞体外培养及下咽生物支架的构建

【摘要】：下咽亦称喉咽，在人体生理解剖中处于要塞位置，向前经喉入口，向下连接食管。下咽癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，体外培养人咽缩肌细胞并构建仿生的下咽生物支架是未来治疗下咽癌的重要方法之一。通过体外构建人工下咽肌组织生物支架及动物实验，可以为修复下咽部缺损肌组织提供新思路，这是临床与组织工程领域的研究热点。支架材料的优劣直接影响体外培养人咽缩肌的形态及功能，关系到整个生物支架的构建。本课题组以聚氨酯（PEU）为基材，利用二元胺胺解交联剂固定接枝生物大分子和大分子层层自组装的技术，促进高分子材料的组织和细胞相容性,，构建了下咽肌组织工程支架。课题分三部分： 第一部分，人咽缩肌细胞的体外提纯、培养、增殖。由于咽缩肌位于提咽肌和腭帆肌内侧，单纯分离咽缩肌极其困难。咽缩肌属于骨骼肌，在分离骨骼肌时必然掺杂着成纤维细胞、内皮细胞、血管内皮细胞等其他成分的细胞，对于获得一定数量且具有体外成活能力的咽缩肌细胞绝非易事。我们采用组织块培养法，可获得纯净的细胞。在显微镜下，可观察到单个肌细胞增殖分化至多核肌管的过程，起初是大量纺锤形的单核细胞在组织块周围出现，达到一定数量后相互融合，随着细胞进入分化阶段则融合成肌管，最终形成具有方向性的功能组织。第二部分，以PEU为基本材料构建平面及立体生物支架。利用二元胺胺解交联剂固定接枝生物大分子和大分子层层自组装的技术，通过接枝丝素蛋白（SF），制备PEU、PEU-SF两组支架，并对支架进行物理性能的检测，包括接触角检测及力学性能分析。用扫描电镜（SEM）观察支架表面的微结构，使用倒置相差显微镜，免疫荧光观察、鉴定细胞的性状以及细胞增殖、分化和成肌的状况，并比较接枝前后咽缩肌细胞和支架相容性的变化。证实接枝丝素蛋白提高了生物支架的细胞相容性和组织相容性，咽缩肌细胞在PEU-SF支架上形成肌管的数量远超PEU支架，且能形成多层立体结构。第三部分，进行动物实验。将生物支架植入裸鼠体内，观察生物支架的降解情况，证实了PEU具有良好的生物降解速率。接枝SF的PEU支架与未接枝相比具有更好的组织相容性，提高了支架植入体内的成功率，降低了排异反应。研究表明，组织块培养法获得的咽缩肌细胞与接枝丝素蛋白的立体凹槽PEU支架复合培养时其生长状况佳，这为体外构建下咽组织瓣提供了一定的条件。