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SS31对ARPE-19细胞线粒体功能及凋亡保护作用的研究

陈泽君  
【摘要】:目的初步探究线粒体靶向肽SS31对ARPE-19细胞的线粒体功能及凋亡的保护作用。方法用不同浓度的H_2O_2(0,100,150,200,250,300,500μmol/L)处理ARPE-19细胞24h,用MTT法检测细胞活性并选择最适浓度建立氧化损伤模型,再用不同浓度的SS31(10nM,100nM,1μmol/L)预处理细胞2h,通过MTT法测定细胞活力并选择SS31的最佳保护浓度。在倒置相差显微镜下观察ARPE-19细胞形态。在荧光显微镜下观察ARPE-19细胞DAPI染色结果。通过Annexin-V/PI染色,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。用MitoSOX red探针染色细胞,在荧光显微镜检测活性氧(ROS)的释放水平。用DCFH-DA探针和流式细胞仪检测ROS的释放水平。用JC-1荧光探针和流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化。用RT-PCR技术测定ARPE-19细胞凋亡相关基因(Bax,Caspase-3和Bcl-2)的表达水平,通过Real-time PCR技术测定这三种基因mRNA水平。使用单因素方差分析(ANOVA)方法,应用统计学软件SPSS 19.0进行统计分析,P0.05有统计学差异。结果用不同浓度H_2O_2处理细胞后,ARPE-19细胞活性均降低并呈浓度依赖性。在各浓度SS31的预处理下,细胞活性均较H_2O_2组增高(P0.05)。单纯SS31作用后,细胞活性与空白组无明显差异。在倒置相差显微镜下观察细胞,随着H_2O_2浓度的增加,细胞数目逐渐减少,形态皱缩。随着SS31浓度的增加,细胞形态及数量趋于正常。在荧光显微镜下观察细胞DAPI染色,H_2O_2组可见强荧光点和细胞核碎片化,而SS31+H_2O_2组细胞的荧光弱于H_2O_2组。流式细胞仪检测凋亡结果表明,H_2O_2+SS31组与H_2O_2组相比,凋亡细胞比例降低(P0.05)。活性氧(ROS)检测结果表明H_2O_2组显示强荧光,H_2O_2+SS31组荧光较其相比明显减弱,表明SS31+H_2O_2组ROS释放水平低于H_2O_2组(P0.05)。线粒体膜电位监测结果表明,SS31+H_2O_2组低线粒体膜电位细胞比例较H_2O_2组降低。凋亡相关基因mRNA水平及表达水平的检测结果表明,SS31可以增加ARPE-19细胞在氧化损伤下Bcl-2基因的表达及mRNA水平,降低Bax以及Caspase-3基因的表达及mRNA水平(P0.05)。结论初步认为线粒体靶向肽SS31可以保护氧化损伤下ARPE-19细胞的线粒体功能和减少细胞凋亡。


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