SERS及其结合免疫技术检测双酚A和丙肝抗体的方法建立与评价

【摘要】：由于表面增强拉曼光谱技术(SERS)的高灵敏检测水平和“指纹”图谱的特点,使得SERS技术在环境检测和医学早期诊断等领域有着非常广泛的应用。本论文基于金、银纳米粒子作为SERS活性基底,并结合现代免疫分析技术,建立了对环境有机小分子污染物双酚A (BPA)和丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)的高灵敏、高选择性的快速分析方法。论文主要开展以下几个方面的研究工作:第一部分基于纳米银颗粒作为SERS活性增强基底,建立了对BPA的SERS免标记检测方法。(1)以纳米银(AgNPs)溶胶聚集体作为SERS基底,以NaCl作为絮凝剂,建立了基于AgNPs聚集体的SERS免标记技术检测BPA的方法。通过优化实验条件,确定了银溶胶pH值为3,添加0.4 mol/LNaCl溶液作为絮凝剂,当BPA溶液与银溶胶体积比为1:1时,AgNPs聚集体对BPA的SERS检测限为0.5 μg/mL。该方法操作简单,能够实现对BPA的快速定性检测。(2)构建了 AgNPs负载的微孔滤膜作为固相SERS增强基底,该基底具有良好的均匀性、稳定性和检测灵敏度。以巯基乙胺盐酸盐(Cys)作为链接剂,通过静电吸附作用将BPA富集浓缩至AgNPs负载的滤膜SERS基底表面,建立了 Cys辅助SERS技术检测BPA的高灵敏分析方法。结果表明,10 mM的Cys在pH为3的条件下预先与BPA静电结合,再通过-SH吸附至AgNPs表面,从而达到了 SERS免标记技术检测BPA的目的。对BPA的最低检测限达到0.005 ng/mL,加标检测在1-10 ng/mL范围内具有良好的回收率,回收率为90.2 %-121.1%。该法将AgNPs颗粒固定在滤膜表面得到固相SERS基底,成本低廉,制备简便,方便携带,能用于水中超痕量BPA的高通量分析检测。第二部分主要基于SERS标记(联合)免疫分析技术建立检测BPA的新方法。(1)基于SERS标记免疫分析方法(SERSIA)的“三明治”结构理论模型,以金/银核壳复合纳米粒子(Au/AgNPs)作为SERS增强基底,建立了检测BPA的高灵敏分析方法。结果表明,该法检测BPA的线性范围为10μg/mL-1ng/mL,最低检测限为1 ng/mL,对BPA的结构类似物不存在交叉反应,对实际水样的添加回收率为78%-123%。(2)基于SRES联合胶体金免疫层析法(SERS-GICA)建立了检测BPA的快速、定量分析方法。以20 nm左右的胶体金作为示踪物和SERS增强基底,组装SERS-GICA试纸条,经过15 min的免疫层析反应,检测试纸条NC膜T线区域拉曼探针分子的SERS信号,从而达到对BPA的快速定量检测。该方法对BPA的最低检出限为0.1 ng/mL,比基于该试纸条的目测法灵敏度高300倍,该方法特别适合于环境小分子污染物的现场、快速、高灵敏分析检测。第三部分基于SERS联合酶联免疫吸附法(ELISA)建立了检测HCV-Ab的超高灵敏度分析方法。以双抗原夹心免疫法为构建原理,以辣根过氧化物酶(HRP)对TMB的催化产物为检测对象,以AgNPs为SERS增强基底,研究酶促产物的SERS信号与HCV-Ab的浓度之间的关系。在最佳实验条件下,该SERS-ELISA法对HCV-Ab试剂盒检测的线性范围为0.625 ～10pg/mL,检测灵敏度高达0.625 pg/mL,高于传统ELISA法的检测灵敏度2.5 pg/mL。该方法与其他SERS标记免疫检测技术相比,灵敏度更高,通过直接检测反应产物的SERS信号,而不引入其他的拉曼探针分子,操作更为简便,对环境友好。并且,由于HRP酶催化TMB显色反应被广泛应用于ELISA免疫分析检测中,因此SERS-ELISA技术具有普适性。SERS技术具有分析速度快,检测灵敏度高的特点,目前在超痕量分析检测领域具有广泛的应用研究。本论文结合了 SERS技术的高灵敏度、高选择性以及现代免疫分析方法的高特异性和普适性,研究了检测小分子物质BPA和大分子蛋白HCV-Ab的分析方法,在环境检测和医学诊断方面具有广阔的应用前景。