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基于CRISPR-Cas12a快速检测非洲猪瘟病毒试纸条的研发

吴靖华  
【摘要】:非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪,野猪(如非洲野猪或者欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病,使全球的养猪业受到严重的危害,从而间接影响到食品安全。目前ASFV至今尚无有效疫苗可用于防控,对ASFV进行早期快速诊断和预防是防止该病爆发的主要手段。在本研究中,我们建立了基于将CRISPR/Cas12a的纳米金侧流层析试纸条检测法,即将CRISPR/Cas12a系统、聚合酶链式扩增反应PCR和胶体金试纸条技术结合起来,研发了一种用于快速检测非洲猪瘟病毒的纳米金试纸条,并分析了其特异性和灵敏度,证实了基于CRISPR/Cas12a的纳米金试纸条检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点,用于非洲猪瘟的检测是非常具有意义的,该种方法有望取代未来的检测手段,在食源性致病菌检测和疾病诊断方面有着广泛的应用价值,该试纸条技术的研发,可以有效地检测有食源性致病菌造成的食品安全问题,确保食品安全。为了建立基于CRISPR/Cas12a系统的纳米金试纸条的检测方法,本论文中主要根据非洲猪瘟病毒的VP73基因,设计了CRISPR/Cas12a系统的g RNA,cr RNA,优化了CRISPR/Cas12a反应中的报告基因的长度以及反应浓度,根据报告基因设计了包被在试纸条上的捕获探针,基于CRISPR/Cas12a系统的纳米金试纸条的检测方法,将试纸条作为检测平台,胶体金作为指示剂,结果显示,其最低检测限值为2.5×10~(-15)M,整个监测体系操作简单,灵敏度高,特异性强,有利于对AFSV的进行早期诊断,进而有效地控制疫情的爆发,保障食品安全。


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