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P物质联合表皮干细胞促进糖尿病创面愈合与神经再生的实验研究

朱飞滨  
【摘要】:目的:探讨糖尿病大鼠表皮干细胞体外分离培养的方法及其生物特性,观察P物质联合表皮干细胞对糖尿病大鼠创面愈合与神经再生的影响,为糖尿病创面的修复提供一种新技术方法,为进一步临床应用奠定实验依据和理论基础。 方法:1)SD大鼠随机分成糖尿病组和正常对照组。糖尿病组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin, STZ,65mg/kg)制备糖尿病大鼠模型,正常对照组不作处理。分别取成模糖尿病和正常大鼠背部全层皮肤,采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸联合消化法分离表皮,Ⅳ型胶原黏附法纯化培养表皮干细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和细胞克隆形成,细胞计数绘制生长曲线,计算克隆形成率,免疫细胞化学染色法鉴定K19、β1-integrin阳性表达,图像分析软件测定阳性细胞的积分吸光度(IA)值。2)取成功建模的糖尿病大鼠48只,于背部脊柱两侧以特制打孔器致直径1.8cm全层皮肤缺损创面,每只大鼠四个创面用随机抽签法随机分为四组(A组:表皮干细胞+P物质组;B组:表皮干细胞组;C组:P物质组;D组:单纯羊膜对照组)其中A、B两组分别用羊膜负载的表皮干细胞移植修复;A、C两组分别于移植后在创周及创中注射10-7mol/L的P物质250μ1,B组和D组同等条件下注射P物质溶剂作对照,每日2次,连用4天。动态观察各组创面愈合情况;创面组织HE染色观察组织学变化;免疫组织化学Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PGP9.5和P物质染色观察创面胶原变化与创面神经再生情况。 结果:1)糖尿病组大鼠表皮干细胞原代贴壁数量较少,其克隆形成率为7.43%±1.21%,明显低于正常对照组的15.37%±2.03%,差异有统计学意义(P0.01)。两组表皮干细胞的K19、β1-integrin均呈阳性表达,糖尿病组阳性细胞的IA值分别为86.17±10.54、26.35±7.63,均低于正常对照组的160.31±36.52、59.46±14.67,差异均有统计学意义(P0.01)。2)与B、C和D组相比较,A组创面愈合时间明显缩短,皮肤组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量明显增多。A、C两组创面组织中有大量PGP9.5和P物质阳性表达神经纤维再生,部分神经纤维末梢向表皮延伸接近表皮组织。B、D组仅见创面组织深层有少量PGP9.5和P物质阳性神经纤维组织表达,未见神经纤维末梢向表皮延伸。 结论:1)在本培养体系条件下能成功的分离培养糖尿病大鼠表皮干细胞,其体外增殖能力较正常皮肤增殖能力弱,可能是导致糖尿病创面难愈的重要因素之一。2)联合应用外源性SP和表皮干细胞可有效促进糖尿病创面愈合与神经再生,为糖尿病创面的修复提供一种新技术方法,为进一步临床应用奠定实验依据和理论基础。


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