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糖尿病大鼠表皮干细胞β-catenin和cyclinD1的表达及其在创面修复中的作用研究

钟清玲  
【摘要】:糖尿病(diabetic mellitus, DM)患者皮肤易受损伤、且损伤后创面愈合延迟或不愈合,目前仍是临床常见难题。国内外研究认为糖尿病创面难愈主要与糖代谢紊乱及晚期糖基化终末产物增多、血管病变及内皮细胞异常、神经病变、生长因子受体等改变、基质金属蛋白酶的表达异常、表皮细胞增殖障碍等因素有关。针对这些靶点衍生出来的治疗策略取得了一定的成效,但仍然不尽如人意。近期研究证实,表皮干细胞(Epidermal Stem Cells, ESCs)作为皮肽组织的特异性干细胞,是皮肤及其附属器发生、修复、改建的源泉,在正常皮肤再生和创面愈合中发挥重要作用;糖尿病创面表皮干细胞数量显著减少、活性明显降低,存在局部特有的“干细胞库干涸”现象。由此提示,表皮干细胞增殖分化特性的改变可能是糖尿病创面难愈的重要原因之一 p-连环素(β-catenin)是一种细胞骨架蛋白,由位于染色体3p21的CTNNB1基因编码。它作为一种重要的上皮细胞分化调节因子,主要通过与上皮细胞钙黏蛋白结合,参与细胞-细胞黏附和细胞与细胞外基质的连接,维持上皮组织结构的完整性,同时它又是调控细胞生长、发育和分化的Wnt信号通路的关键信号传递子,在通路中发挥枢纽作用。β-catenin水平增高时,Wnt信号通路激活,激活下游靶基因细胞周期蛋白D1(cyclin Dl)等,促进细胞增殖与分化。业已研究证实β-catenin能够促进肠道上皮干细胞增殖分化,并参与肠黏膜受损后的修复过程,表明β-catenin与成体干细胞的增殖分化密切相关。Wnt和β-catenin表达增强,表皮细胞的增殖分化和迁移能力增强,创面愈合加快。但β-catenin和Cyclin Dl在糖尿病皮肤表皮干细胞中的表达及其在创面修复中的作用尚不清楚。本实验采用糖尿病大鼠模型,观察糖尿病大鼠皮肤与正常大鼠皮肤组织表皮干细胞定位、β-catenin和cyclinDl的表达差异;采用表皮干细胞体外培养模型,研究糖尿病大鼠皮肤表皮干细胞β-catenin和cyclinD1基因及其蛋白的表达特征;采用糖尿病大鼠创面模型,探究表皮干细胞移植对糖尿病创面愈合的影响以及β-catenin和cyclin D1的表达变化,为其在创面修复中的进一步应用奠定实验基础和理论依据。 第一部分糖尿病大鼠皮肤组织表皮干细胞定位及β-catenin和cyclinD1表达检测 目的:观察糖尿病大鼠皮肤组织表皮干细胞定位和β-catenin、cyclinD1及其相关蛋白的表达检测,探讨其在糖尿病皮肤难愈创面修复中的意义。 方法:20只SD大鼠随机分为DM组和正常对照组。DM组大鼠采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin, STZ,65 mg/kg)制备DM大鼠模型,成模第四周取大鼠背部全层皮肤,取两组大鼠胰腺组织,HE染色观察胰岛组织学变化。并取正常皮肤标本作为对照,行HE染色及β-catenin、cyclinD1、Wnt1、角蛋白19(keratin19,K19)、β1整合素(β1-integrin)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)免疫组织化学染色,图像分析软件测量阳性细胞积分吸光度(integral absorbance,IA)。 结果:DM大鼠连续4周血糖监测均16.7 mmol/L且血糖波动小,DM模型具良好稳定性,建模成功率为90%。DM组胰腺HE染色可见胰岛细胞数目明显减少,出现变性坏死;对照组胰岛细胞结构清楚,无变性坏死。表皮基底层均可见表皮干细胞的标志物K19和β1-integrin阳性表达,β-catenin、cyclinD1、Wnt1、PCNA阳性细胞集中在表皮基底层,但DM组皮肤组织表皮β-catenin、cyclinD1、Wnt1、PCNA、K19和β1-integrin的表达均显著低于正常对照组皮肤(P0.01)。DM组与正常对照组大鼠皮肤中β-catenin [(169.78±37.29), (217.88±23.51),P0.01]、cyclinD1[(156.37±32.46),(198.26±22.15),P 0.01]、Wnt1[(138.63±23.45),(175.82±25.12),P0.01],PCNA[(143.17±19.82), (175.05±20.84),P0.01]、K19[(139.54±20.69),(168.96±17.97),P0.01]和β1-integrin[(150.58±9.98),(181.79±15.94),P0.01]的阳性细胞积分吸光度相比差异显著,有统计学意义。 结论:糖尿病大鼠皮肤表皮干细胞主要位于表皮基底层,β-catenin和cyclinD1阳性表达区域和信号强度与表皮干细胞定位分布及阳性表达强度相一致。提示糖尿病大鼠皮肤中表皮干细胞数量减少和β-catenin、cyclinD1的表达减弱可能与糖尿病皮肤修复能力的降低密切相关。 第二部分体外培养观察糖尿病大鼠表皮干细胞β-catenin和cyclinD1的表达特征 目的:在体外培养条件下,观察糖尿病皮肤表皮干细胞β-catenin、cyclinD1及其增殖分化相关蛋白的表达特征,以探究DM皮肤创面难愈的潜在机制。 方法:40只SD雄性大鼠随机分为DM组和正常对照组。DM组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素65mg/kg制备DM大鼠模型,正常对照组不作处理。注射后4周取两组背部全层皮肤,分离培养ESCs,流式细胞仪检测细胞周期,细胞接种1周后检测两组细胞克隆形成率。分别取两组ESCs行免疫细胞化学染色鉴定β-catenin、cyclinD1、Wnt1、PCNA、K19和β1-integrin阳性表达;采用RT-PCR和Western blot检测β-catenin、cyclinD1、Wnt1mRNA和蛋白表达。 结果:倒置相差显微镜下观察,DM组与正常对照组相比,表皮干细胞数量明显减少,生长速度缓慢,DM组ESCs克隆形成率为6.43%(12.87+2.03/200%)明显低于正常对照组的11.37%(22.75±3.24/200%),比较差异有统计学意义(P0.01)。流式细胞仪分析DM组ESCs88.89%处于静息期/DNA合成前期(G0/G1期),凋亡细胞数3.98%;正常对照组ESCs91.50%处于G0/G1期,无凋亡细胞。DM组大鼠ESCs的K19、β1-integrin、β-catenin、cyclinD1、Wnt1及PCNA阳性表达的积分吸光度(IA)值分别为82.63±14.77、21.59±4.71、76.49±6.58、69.35±5.82、32.57±6.13、90.77±12.44,均低于正常对照组(分别为151.24±42.83、54.48±17.43、116.39±9.26、105.47±7.52、71.29±8.25、110.62±20.67),比较差异有统计学意义(P0.01)。DM组表皮干细胞β-catenin[(0.556±0.017), (0.850±0.059),P0.01]和cyclinD1[(0.682±0.023),(0.887±0.038),P0.01] mRNA表达水平均显著低于正常对照组。Western blot检测β-catenin和cyclinD1在两组均有表达,但DM组的表达强度(0.583±0.054,0.840±0.007)低于正常对照组(1.128±0.077,1.307±0.072)(P0.01)。 结论:1.两组体外分离培养的表皮干细胞呈克隆性生长,G0/G1期细胞比例高,β1-integrin和K19免疫细胞化学染色均呈阳性表达,表明在本实验培养条件下分离培养的表皮干细胞具有干细胞的生物学特性。但DM组ESCs生长速度缓慢,克隆形成能力减弱。 2.糖尿病大鼠皮肤表皮干细胞P-catenin和cyclinDlmRNA及其蛋白表达均明显降低。提示β-catenin和cyclinD1表达减弱引起糖尿病大鼠皮肤表皮干细胞增殖能力明显下降和数量显著减少,可能是导致糖尿病创面难愈的重要机制之一。 第三部分表皮干细胞移植对糖尿病大鼠创面愈合的影响及β-catenin和cyclinDl的表达变化 目的:观察表皮干细胞移植对糖尿病大鼠创面愈合的影响及β-catenin和cyclin D1的表达变化,为糖尿病难愈创面的治疗提供新思路。 方法:雄性SD大鼠20只用于建立糖尿病模型,雄性SD大鼠10只用于制备表皮干细胞。分离培养及鉴定SD大鼠ESCs,并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记。建立糖尿病SD大鼠创面模型,随机分为A、B、C三组,A组创面移植羊膜负载BrdU标记的ESCs; B组创面移植羊膜;C组为空白对照组,创面未给予干预。观察创面愈合情况、计算创面愈合率,HE及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU、K19、β1-integrin、β-catenin、cyclinD1、Wnt1及PCNA的表达。用图像分析软件测量阳性细胞积分吸光度。 结果:与另两组相比,表皮干细胞移植组新生表皮下胶原分布均匀,排列较整齐,在不同观察时期的创面愈合率明显增高且组间比较差异均有显著统计学意义(P0.01)。表皮干细胞移植组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,而另两组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞。各组创面组织中可见K19、β1-integrin、β-catenin、cyclinD1、Wnt1和PCNA阳性细胞表达,但A组的阳性细胞积分吸光度与B、C组比较差异显著(P0.01)。 结论:表皮干细胞移植可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合,且在新生表皮基底层表皮干细胞标志物K19、β1-integrin与β-catenin、CyclinD1的表达均增强。提示P-catenin和CyclinD1活性表达的变化可能是表皮干细胞促进糖尿病大鼠创面愈合的重要机制之一。


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