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褶纹冠蚌热休克蛋白基因克隆与表达及2种淡水蚌的血细胞分析

谢彦海  
【摘要】:本研究采用RACE技术从褶纹冠蚌中克隆到HSP70和HSP90基因的cDAN序列,以及从褶纹冠蚌基因组中克隆出HSP70和HSP90基因组序列。 HSP70基因cDNA序列全长为2664bp(基因登录号:ADM64336),其中5’UTR有364 bp;3’UTR有383 bp,在N末端存在4个RNA不稳定模体ATTTA和26bp的poly (A); HSP70基因的开放阅读框为1917bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3kD。根据HSP70基因cDNA序列推导氨基酸序列发现,氨基酸序列含有HSP70家族的三个标签序列,含有4个糖基化位点,以及保守的EE (V/M) D多肽结构。HSP70氨基酸包括一个由380个氨基酸组成ATP酶结构域,一个由159个氨基酸组成的底物肽结合结构域,以及一个由82个氨基酸组成的C端结构域。HSP70基因组全长发现,HSP70基因的ORF内不存在内含子。 HSP90基因cDNA序列全长为2674bp(基因登录号:ADN87332),其中5’UTR有83 bp;3'UTR有410 bp。该序列包括1个28bp的poly (A),1个AATAAA加尾信号以及1个RNA不稳定模体ATTTA; HSP90基因的ORF为2181bp,编码726个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.05,分子量为83.47kD。根据HSP90基因cDNA序列推导氨基酸序列发现,氨基酸序列含有HSP90家族的5个标签序列,3个糖基化位点,以及C末端存在保守的MEEVD多肽结构。同时,推测该序列含有由155个氨基酸组成ATP酶结构域。HSP90基因组序列全长9739bp;其中在ORF中有8个外显子,7个内含子。 利用半定量PCR和荧光定量PCR研究了热处理、嗜水气单胞菌、重金属刺激下,HSP70 mRNA和HSP90 mRAN的表达量。 热休克刺激后,蚌5种组织的HSP70 mRNA表达量均显著高于对照组,其中血液和鳃内的表达量变化最显著,其次是外套膜和肝胰腺,而肌肉内的表达量变化不明显。嗜水气单胞菌刺激6h后,仅血液和外套膜组织中HSP70 mRAN的表达量显著增加,而其它组织增加不明显,12h后各组织的表达都达到峰值,其中血液、鳃和肌肉内的表达量增加最为显著,随后逐渐下降,48h表达水平恢复到正常状态。 不同温度刺激下,蚌血细胞中HSP70 mRNA的表达变化显著,其中35℃时表达量是5℃时表达量的99042倍,而15℃,25℃时HSP70 mRNA的表达量仅为5℃时的16.1倍和13.4倍。在重金属(Cd2+)刺激下,HSP70 mRNA的表达量都随时间的增加而升高,表达峰值出现在15d,而20d时表达量急剧下降,接近正常表达水平。在重金属(Cr6+)刺激下,5d时,HSP70 mRNA的表达量增加不显著,随刺激时间的增加,表达量逐渐的升高,15d时表达量都达到最大值,随后表达量开始逐渐下降,20d时表达量下降到正常状态水平。 热休克刺激后,蚌5种组织HSP90 mRNA表达量明显的增加,其中在血液、肌肉和肝胰腺内的表达量增加最大,而鳃和外套膜的表达量相对小。嗜水气单胞菌刺激后,HSP90mRNA的表达量明显地增加,但5种组织间的相对表达量没有明显的差异。不同时间段的刺激中,发现随刺激时间的增加,HSP90 mRNA的表达量也增加,到12h时表达量达到最大值,之后表达量趋于稳定,随后表达量开始下降,48h后表达量恢复到刺激前的水平. 不同温度刺激下,HSP90 mRNA的表达量随温度的升高而增加,35℃时,蚌处于热休克状态,此时HSP90 mRNA的表达量是5℃时表达量的130倍。不同浓度Cd2+刺激蚌后,蚌内HSP90 mRNA的表达具有不同的变化趋势,但都表现为正调节作用。当Cd2+的浓度为50μg/L和100μg/L时,表达峰值分别出现在15d和20d,随后表达量开始下降,而Cd2+浓度为200μg/L时,峰值出现在5d,随后表达量趋于高位稳定。重金属Cr6+刺激后,随着刺激时间的增加,HSP90mRNA的表达量随之增加。浓度1μg/L和10μg/L时,表达峰值出现在15d,而Cr6+浓度为100μg/L时,HSP90表达峰值均出现在10d,随后表达量逐渐下降,20d时恢复正常水平。 为了进一步探讨HSP70和HSP90的功能,通过双酶切连接,构建了pET30-HSP70和pET30-HSP90原核表达系统,成功表达了两种蛋白。SDS-PAGE分析发现HSP70和HSP90在IPTG的诱导下,随诱导时间的增加,蛋白表达量逐渐增加,8h时表达量最大。 利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体。用Western-blotting分别检测褶纹冠蚌血、鳃、肌肉、肝胰腺和外套膜五种组织中HSP70和HSP90的蛋白表达量。结果显示,热休克(35℃)后,五个组织中HSP70的表达量相对于室温(20℃)时的表达量显著增加,其中血、鳃、外套膜和肝胰腺组织的表达量高,而肌肉的表达量相对较少。热休克(35℃)后,五个组织中HSP90的表达相对于室温(20℃)时的表达量增加明显,其中血液的表达量最大,其次是肝胰腺和肌肉,而鳃和外套膜的表达量增加相对较少。 褶纹冠蚌和背角无齿蚌血细胞形态极其相似,都可分为大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞和淋巴样细胞四种。两种蚌不同亚型之间所占的比例有所差别,其中小颗粒细胞为数量最多的细胞类型,分别占血细胞总数比例分别为(56.6±1.41)%和(59.28±0.89)%;透明细胞也是数量较多的细胞类型之一,占血细胞总数比例分别为(37.8±2.11)%和(27.74±0.56)%;大颗粒细胞数量较少,所占比例分别为(4.2±0.23)%和(4.28±0.35)%。淋巴样细胞比例分别为(2.4±0.12)%和(8.70±0.23)%。


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