白藜芦醇抗心肌缺血再灌注损伤的线粒体机制研究

【摘要】：白藜芦醇是一种生物活性多样的多酚类化合物,主要存在于葡萄、花生、虎杖等食品和药材中。白藜芦醇具有良好的心血管保护、抗衰老、抗肿瘤等营养保健作用,是分子营养学和药理学热门研究对象之一。近年来国内外研究发现白藜芦醇具有显著的抗心肌缺血再灌注损伤保护作用,但其作用机制尚不明确。线粒体为心肌中含量最丰富的细胞器,白藜芦醇对心肌损伤的保护作用,很有可能与线粒体相关。线粒体不仅为心肌提供能量,而且在维持细胞的Ca2+稳态、调节细胞凋亡或坏死等过程中起着决定性作用,其功能障碍与线粒体通透性转换孔道(mitochondria permeability transition pore, mPTP)密切相关。mPTP的开放是缺血再灌注损伤从可逆向不可逆过渡的一个关键因素。其中位于mPTP外膜上的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)控制着离子和代谢物的转运,对于mPTP的开放和关闭起重要作用。故我们推测VDAC可能是白藜芦醇的抗心肌缺血再灌注保护作用的线粒体靶点。 本课题采用H9c2心肌细胞株,利用基因克隆和RNA干扰(RNAi)技术,通过体外缺血再灌注损伤模型,即缺氧/复氧(A/R)损伤模型,测定在VDAC1蛋白正常表达、低表达和高表达,以及细胞外液无C1-等不同情况下,白藜芦醇对心肌细胞、线粒体功能及线粒体介导的凋亡通路的作用。利用流式细胞仪测定细胞内或线粒体内Ca2+、活性氧(ROS)深度变化,荧光分光光度计检测C1-浓度的变化,以进一步阐明白藜芦醇对急性心肌损伤保护的分子生物学机制。现将本论文主要研究结果归纳如下： 1.探讨了白藜芦醇对H9c2心肌细胞A/R损伤保护作用的量效关系。MTT法检测细胞存活率；按试剂盒说明测定细胞内LDH和CPK的活性、MDA含量以及抗氧化物酶SOD和GSH-Px的活性；流式细胞法检测心肌细胞内Ca2+浓度、ROS、线粒体膜电位及细胞凋亡；分光光度计法测定mPTP的开放。结果发现50μM的白藜芦醇可发挥最佳心肌保护作用,降低LDH和CPK活性,提高心肌细胞存活率,提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性,减少ROS生成和MDA含量,防止钙超载和mPTP开放,维护线粒体膜电位,减少细胞凋亡。 2. Western blot法检测白藜芦醇及A/R损伤对VDAC1表达的影响。结果发现A/R损伤可上调VDAC1的表达,而白藜芦醇则可抑制VDAC1的表达。 3.通过RNAi技术进一步明确VDAC1在A/R损伤导致mPTP开放中的意义。结果表明,RNAi特异性沉默VDAC1后可显著减轻A/R后的氧化应激、钙超载、维护线粒体膜电位,防止mPTP开放,从而抑制细胞色素c(Cyt c)的释放和caspase-3的激活,减少细胞凋亡。说明VDAC1在A/R损伤引起mPTP开放及线粒体凋亡通路激活中发挥着重要的作用。 4.构建VDAC1真核表达载体pFLAG-VDAC1,采用基因转导技术建立VDAC1蛋白高表达组,通过反向验证进一步明确白藜芦醇心肌保护作用与VDAC1的关系。结果表明导入pFLAG-VDAC1后可取消白藜芦醇的心肌保护作用,说明白藜芦醇的心肌保护作用就是由VDAC1介导的。 5.深入探讨VDAC1参与mPTP开放的调节机制。通过流式细胞仪检测线粒体内C1-浓度发现,A/R损伤时线粒体内C1-浓度明显升高,而利用RNAi下调VDAC1水平则可减少线粒体内C1-浓度,并且白藜芦醇预处理或去除细胞外Cl-也可有效降低线粒体内C1-浓度,导致Ca2+浓度下降,ROS生成减少,防止mPTP开放。此结果说明VDAC1就是C1-进出线粒体的主要通道,并且C1-在mPTP开放调节和VDAC介导的白藜芦醇抗急性心肌保护作用及线粒体功能维护中发挥着重要的作用。 上述结果表明：白藜芦醇通过抑制A/R损伤时VDAC1的表达,减少C1-进入线粒体,取消“氯增加诱发钙小体释放机制”的触发作用,从而减轻Ca2+超载和氧化应激,防止mPTP开放,维持线粒体膜电位,抑制Cyt c的释放及caspase-3的活性,最终显著减少细胞凋亡。