动物源性食品中残留的瘦肉精与血清白蛋白相互作用规律

【摘要】：食品安全问题已成为全世界普遍关心的热点问题,由于农药和兽药的大量使用而对食品安全性产生的影响,已成为近年来人们关注的焦点。人们食用动物源性食品时,就必然要接触残留在动物体内的药物或激素。其中β-肾上腺素受体激动剂类促生长激素,又称瘦肉精或β-兴奋剂,是人工合成的蛋白质同化激素,具有脂肪再分配功能,一般认为将这类激素用于养殖业,可促进畜禽和水生动物的生长,提高饲料转化率,减少脂肪和增加瘦肉率,使动物组织发生重新分布。但此类药物使用的直接后果是导致药物在动物性食品中残留,摄入人体后,将严重影响人类的健康,故目前包括我国在内的很多国家禁止其在动物的饲料和饮用水中使用。但由于动物饲料中非法使用屡禁不止,导致动物食品中瘦肉精残留严重,对人类安全造成重大影响,世界各地出现多起中毒事件。本论文采用荧光、紫外和红外光谱法、伏安法结合化学计量学研究瘦肉精与蛋白质之间的作用模式和作用特征,探讨其作用机制,从分子水平上理解和阐明瘦肉精分子在体内的传输、代谢过程、中毒机制。对兽药小分子设计和分子结构改造及指导解毒急救,并阐明动物源性食品中兽药残留的来源与原因,为食品质量与安全研究提供有用的信息和数据,以用来鉴定和控制食品安全中的潜在危害。 第一章：先阐述选择动物源性食品中残留的瘦肉精为研究对象的原因。再介绍小分子与血清白蛋白相互作用的意义。从研究方法、研究内容等方面展开了评述,重点介绍了与食品相关的农药、食品添加剂与兽药小分子与血清白蛋白相互作用研究的发展趋势。探讨了化学计量学在小分子与血清白蛋白相互作用研究中的优势。最后阐明动物源性食品中残留的瘦肉精与血清白蛋白相互作用的重要性和必要性。 第二章：模拟人体生理条件(pH=7.4),用光谱法结合多元曲线分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)研究盐酸克伦特罗(CLEN)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。应用MCR-ALS对同一滴加模式的荧光和紫外光谱法2种扩展光谱矩阵进行迭代计算,较好地分辨出传统方法无法得到的动态作用中各种物质的光潜图和浓度变化趋势图,并根据浓度趋势图计算出CLEN与BSA的表观结合常数和结合比,结果与用双对数方程得到的结合常数和作用位点数吻合。通过同步荧光光谱法进一步发现克伦特罗对BSA的构象有一定的影响。从结果可知CLEN与BSA的结合常数达到106L mol-1,血清结合率高,在体内消除慢,作用维持时间长,不易代谢,在内脏和组织中形成严重的蓄积性残留,危害食品安全和人类健康。 第三章：本体系采用荧光、紫外和红外三种光谱法研究了生长促进剂-莱克多巴胺(RAC)与与牛血.清白蛋白(BSA)的相互作用。用多元曲线分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)解析三种不同的滴加方式的两种不同的光谱的扩展光谱矩阵,从解析的浓度变化趋势图和纯光谱图可知体系中存在BSA、RAC和RAC-BSA三种组分,所以RAC可与BSA形成复合物。同步荧光和红外光潜证实RAC的存在会改变BSA的构象,所以动物性食品中激素RAC的残留量虽然低,但一日.通过食物链进入人体,会对健康产生危害。虽然CLEN与RAC的结合常数都达到106L mol-1,但从两者的结构看,CLEN的苯环上有使苯环钝化的卤基所以不易代谢,在体内消除慢；而RAC的苯环上有使苯环活化的酚羟基,容易发生作用,在体内维持时间相对更短,更易代谢,所以成为CLEN的替代品。 第四章：两种β-肾上腺素受体激动剂莱克多巴胺(RAC)和克伦特罗(CLEN)都有同化蛋白质的作用,使动物组织重新分布,减少脂肪的含量增加瘦肉率。因瘦肉精的对人的副作用在许多国家都禁止使用,但瘦肉精中毒事件还是屡有发生,因此研究两种或多种瘦肉精同时与BSA作用迫在眉睫。从上两章通过MCR-ALS解析重叠的光谱图可知在平衡时CLEN与BSA的结合比为1,RAC与BSA的结合比为2,两种瘦肉精都结合在BSA的site I位。从双对数方程计算可知两种瘦肉精同时存在的结合常数大于单独存在时的结合常数。用平行因子分析(PARAFAC)解析莱克多巴胺和克伦特罗两种瘦肉精与BSA相互作用的三维荧光光谱矩阵,得到瘦肉精小分子与生物大分子在动态作用过程中各组分的浓度变化趋势图；和确认反应中生成三元复合物；在作用过程中的各组分的动态平衡比。由PARAFA(分辨出的激发光谱和发射光谱与真实激发和发射光谱的吻合证明了平行因了分析法的准确性和唯一性,从而进一步解释两种瘦肉精同时存在时在反应中所起的作用-协同作用：两种以上药物作用出现“1+12”的效果。这不仅说明两种瘦肉精同时存在使血浆结合率增大,在动物性食品中的残留增多,作用维持时间久,副作用增强,毒性增大;且对兽药瘦肉精残留的最高残留限量标准提出了更高的要求。 第五章：左旋多巴和盐酸多巴胺作为新型的瘦肉精替代品,添加到饲料中能促进家畜生长,提高饲料转化率,具有很高的隐藏性,通常不会被纳入常规瘦肉精检测。但是,左旋多巴和盐酸多巴胺对人畜均会产生严重的毒副作用。本文用伏安法和荧光法两种测量方法研究小分子左旋多巴(levodopa)和盐酸多巴胺与生物大分子(BSA)的相互作用。由多元曲线分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)解析伏安法和荧光光谱扩展的数据矩阵得到的浓度变化趋势图可知左旋多巴与BSA在平衡时的比为3-(levodopa)3-BSA。从伏安曲线可知,复合物是有电化学活性的,但如果左旋多巴被包裹在BSA的疏水性空腔,复合物是没有电化学活性的,因而推知左旋多巴与BSA的结合使BSA折叠的复合物结构打开,BSA上的色氨酸和酪氨酸残基裸露接触电极表面,复合物从而有电化学活性。荧光猝灭证实左旋多巴与BSA的作用为生成复合物的静态猝灭,多巴胺与BSA为动态猝灭,这可能是多巴胺难以通过血脑屏障到达中枢神经系统发挥药效的原因。从多巴胺和左旋多巴在体内的转运过程看,多巴胺在血液中贮存时间短,而左旋多巴贮存时间长,所以毒副作用更强。 第六章：表面活性剂在与人体接触的媒介如食品、药物、化妆品及个人卫生用品中的应用越来越广泛。这个体系着重于研究在离子型的表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)存在下,光谱法结合化学计量学研究瘦肉精沙丁胺醇(SAL)与BSA的相互作用。首先单独研究了SAL与BSA的作用规律和作用位点,由热力学常数可知SAL与BSA之间的作用力组要为范德华力和氢键。再比较表面活性剂不存在／存在时沙丁胺醇与BSA作用时的结合常数的变化,从结合常数的变化探讨不同种类的表面活性剂存在时兴奋剂的作用；并用探针实验确认SDS、CTAB和沙丁胺醇在BSA上的结合位点。通过MCR-ALS解析两种不同滴加方式的荧光光谱扩展矩阵,确认CTAB和沙丁胺醇与BSA的结合比分别为(CTAB)4-BSA和(SAL)2-BSA。用PARAFAC解析三维荧光光潜,得到表面活性剂、沙丁胺醇和BSA三者同时存在相互作用的浓度变化趋势。从分了水平探讨表面活性剂的存在对沙丁胺醇与BSA作用的影响：表面活性剂CTAB会使SAL与BSA的结合常数增大,进而难以代谢,尿检不易检测；而在SDS存在下,SAL难以与BSA结合,游离态增多,新陈代谢快,尿检容易检测。