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钝齿棒杆菌ArgR的凝胶阻滞实验及单增李斯特菌actA、inlB、p60表达载体的构建

袁永  
【摘要】:L-精氨酸是一种半必需氨基酸,是人体多种重要机体组织代谢物的中间体,在医药和食品工业中具有十分广泛的用途。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542是我国研究者从土壤中分离到的一株革兰氏阳性菌,其突变株在国内氨基酸发酵生产中被广泛应用。 ArgR是钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中的一个重要调控蛋白。本实验构建了ArgR的重组表达菌株BL21(DE3)/pET22b-argR。在33℃,以IPTG诱导8h实现了ArgR高效可溶性表达。用纯化后的ArgR制备小鼠多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价达1:160000。Western blotting结果表明,ArgR重组蛋白在体外可自发形成具有生物活性的多聚体。 在钝齿棒杆菌精氨酸代谢途径中,可能受到ArgR调节的基因有六个:argC、 argJ、argB、argG、argF以及carAB。为验证ArgR对以上基因上游DNA序列的结合作用,分别将其与ArgR进行凝胶阻滞实验,结果表明,ArgR对位于argB、 argF以及carAB上游的DNA序列均有结合反应,其中ArgR对carAB上游的DNA序列结合能力最为显著。 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是李斯特菌属中唯一能引起人类疾病的人兽共患病病原菌,也是我国食源性致病菌监控网络体系中重点监控的致病菌之一。本实验通过PCR扩增获得LM actA、inlB、p60全长,并将克隆至原核表达载体pET22b(+)中,构建了重组表达载体pET22b(+) pET22b(+)-inlB以及pET22b(+)-p60,为大量表达单增李斯特菌特异性膜蛋白抗原奠定了实验基础。


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