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解磷菌和相思根瘤菌高密度培养研究及相思根瘤菌16S rDNA序列分析

尚军红  
【摘要】:相思作为豆科树种,其共生固氮作用日益受到重视。研究表明:在大叶相思(Acacia auriculaeformis A.Cunn.)和马占相思(Acacia mangium Willd.)吸收的氮素中,52%~66%来自根瘤菌的固氮作用。目前对相思研究多集中在固氮共生体间的相互作用方面,对在共生体中发挥固氮作用的相思根瘤菌的优化培养,则未有报道。利用微生物的解磷作用弥补土壤磷素营养的不足,已成为当前国内外非常关注的研究课题。因此,本课题着重研究了相思根瘤菌及与它相关的解磷菌优化培养条件,该研究结果为研制具有固氮、解磷功能的微生物肥料提供了条件和基础。同时本课题对相思根瘤菌三个菌株进行了16S rDNA基因序列测定与分析,以确定它们与其它根瘤菌的亲缘关系。 1).绘制了相思根瘤菌AJ018、YM2和MZ菌株和解磷菌217菌株在4种培养基中的OD值生长曲线,结果表明:它们都能在BSE培养基中较好的生长;应用正交实验L_9(3~4)对AJ018、YM2和MZ根瘤菌和217解磷菌的常规培养进行优化,获得了它们的优化培养基,进一步绘制的生长曲线证明了优化培养基更利于菌株的生长,且活菌数更多。 2).通过对相思根瘤菌和解磷菌摇瓶发酵中种子菌龄、接种量、装液量、初始pH值和摇床转速等工艺条件的研究,确定出摇瓶发酵的最优培养条件。同时217解磷能力的研究也表明:菌体数量与pH值、解磷强度之间有着密切的关系。另外用乙炔还原法测得它们的最高固氮酶活性表明:在AJ018、MZ和YM2三株菌株中,MZ菌株的固氮能力最好,其固氮酶活性最高可达0.963μg.mL~(-1).d~(-1);YM2的固氮能力最差,其最高固氮酶活性仅为0.280μg.mL~(-1).d~(-1)。 3).制作了相思根瘤菌MZ和217解磷菌8种固体载体的固体剂型,并比较其在贮藏过程中的活菌数和存活率。结果表明相思根瘤菌MZ在这8种固体载体保存效果较差,保存效果最好的是轻质碳酸钙,其活菌数和存活率分别为1.38×10~5和10.1%。而217解磷菌的8种固体载体保存效果较好,特别是高岭土、微细胞滑石粉和轻质碳酸钙,但高岭土要优于微细胞滑石粉和轻质碳酸钙。 4).测定了相思根瘤菌的16SrDNA序列,将此序列与根瘤菌各已知种及相关种的16SrDNA序列进行了比较,得到了系统发育树状图。在系统发育树状图中,AJ018、MZ菌株与慢生大豆根瘤菌(B.japonicum)、弗氏中华根瘤菌


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