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基因芯片技术在黄曲霉毒素生物合成相关基因检测中的应用研究

胡娜  
【摘要】:黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是最常见的一类真菌毒素,广泛分布于土壤、动植物特别是花生、玉米等人类传统农作物中。因其对人和动物肝脏组织有严重的破坏作用,并可导致肝癌甚至死亡而被世界卫生组织定为Ⅰ致癌物。 本文采用Plackett-Burman(PB)试验筛选出对毒素产量影响显著的生长因子,然后采用响应曲面法研究了各关键因子对寄生曲霉AS3.4407和黄曲霉AS3.4408产毒的影响以及它们间的交互作用,得出菌株产毒量最低和最高时所对应的环境条件,为实践中粮食作物等的AFT污染控制提供理论依据和针对性措施。此外,本实验结合RT-PCR方法成功建立了基因芯片制备技术,搭建了可用于分析黄曲霉毒素生物合成相关基因的生物芯片技术平台,并筛选出与产毒相关的6个差异表达基因,初步分析了差异表达基因与黄曲霉毒素产生的相关性。为高通量筛选真菌中与产真菌毒素相关的基因提供技术支持。主要研究结果如下: 1 建立了改进的HPLC联合荧光检测器检测黄曲霉毒素的方法。用三倍体积氯仿提取样品中的黄曲霉毒素B_1。用HPLC-荧光检测器检测。HPLC的色谱条件为:反相C_(18)柱(250×4.6mm),流动相为甲醇:乙腈:水(30:20:50,v/v/v),流速0.8mL/min。该法最低检出限为2ng/mL,AFB_1加标量为6.25~1000ng/mL时,发酵液中AFB_1的平均回收率为86.4~96.8%,变异系数小于7.0。提取液无需过柱纯化,可以直接进行检测。该方法不但可以将待检毒素与其它杂质有效分离,而且可以同时检测其它三种与AFB_1结构非常相似的AFB_2、AFG_1和AFG_2。 2 通过PB试验确定转速、温度和初始pH三因子对寄生曲霉AS3.4407的毒素产量影响显著(p<0.001),利用中心组合设计建立了寄生曲霉产毒预测模型Y=338.45-7.98X_1-7.82X_2+43.25X_3-34.1X_1~2-26.93X_2~2-22.9X_3~2+5.35X_1X_2-10.76X_1X_3-0.069X_2X_3。由回归模型来分别预测菌株产毒量最高和最低时的环境条件及相应产量,结果显示寄生曲霉AS3.4407产毒量在最适条件下可达350ng/mL以上(转速174rpm、温度27.7℃、pH6.0),而在不适条件下约为200ng/mL(转速240rpm、温度18.0℃、pH8.0),实验值与预测值之间的相关系数为0.99,证明应用此模型能够很好地预测不同生长环境条件下的产毒情况。


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