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严重烫伤大鼠TLR4和Treg的变化及连翘对其影响

傅颖珺  
【摘要】: 严重烫伤早期因肠源性感染引起肠道细菌和内毒素(endotoxin,ET)移位,激发先天性炎症反应和免疫功能紊乱是其引起全身炎症反应综合征(SIRS)的重要机制之一。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)作为一种重要的LPS跨膜信号转导受体参与了内毒素诱发炎症的病理过程,同时在免疫系统对入侵病原体的早期识别过程中即抗感染免疫中扮演举足轻重的角色。CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+ regulatory T cell ,Treg)是近年来发现的免疫系统内具有独特免疫抑制功能的T细胞亚群,转录因子Foxp3(Forkhead/ winged helix transcription factor)是Treg的特征性标志之一,感染状态下,Treg最主要的功能就是调节有效控制病原体的T细胞反应和导致严重炎症及组织破坏的过度T细胞反应之间的平衡。近年来,已经发现连翘具有抗内毒素及免疫调节作用,但其确切作用机制尚不清楚,它在LPS-TLR4信号转导通路这一内毒素血症导致疾病发生重要环节中的作用及对Treg的影响,未见报道。本研究的目的是分析严重烫伤大鼠脾脏TLR4、外周血ET和Treg的关系,TLR4在烫伤后多脏器损害中的作用及连翘对TLR4、ET、Treg及Foxp3的影响,从而为阐明TLR4和Treg在烫伤后免疫失衡发病机制中的作用奠定基础,并为寻找治疗严重烫伤后SIRS的有效方法提供新的思路。 第一部分:严重烫伤大鼠脾脏TLR4表达与外周血Treg的变化及相互关系 研究目的:观察严重烫伤早期大鼠脾脏TLR4、TNF-αmRNA的表达变化及外周血Treg和内毒素ET的变化规律,探讨烫伤后内毒素血症对机体免疫系统的影响。 研究方法:将大鼠随机分成正常对照组和烫伤组,在其背部造成30%体表面积Ⅲ度烫伤模型,在烫伤前及烫伤后2、5、8、12、24、48及72 h等不同时间点留取脾脏组织和外周血,RT-PCR方法测脾脏TLR4、TNF-αmRNA表达,Western blot法测脾脏TLR4蛋白表达,流式细胞术检测外周血Treg百分数,鲎试剂法测血浆内毒素含量。 主要结果:烫伤后各时间点上述观测指标值较伤前显著升高,TLR4 mRNA、TLR4蛋白、Treg和ET均在烫伤后8 h达高峰;TNF-α表达高峰在烫伤后12 h;各观测指标峰值与正常对照组比较,差异有极显著意义(P0.01 )。烫伤后TLR4 mRNA的表达与Treg、ET及TNF-αmRNA之间均呈正相关(P0.01)。 结论:LPS-TLR4信号通路在严重烫伤早期显著上调,这可能是严重烫伤后全身炎症反应综合征发生的机制之一;严重烫伤后外周血Treg显著增加,其对机体免疫系统的抑制,可能是严重烫伤后细菌移位的机制之一;在严重烫伤早期TLR4表达与Treg呈正相关,烫伤后肠源性内毒素上调的LPS-TLR4信号转导系统可能促进Treg的增加。 第二部分:严重烫伤大鼠重要脏器损害与TLR4表达的关系及其意义研究目的:通过测定严重烫伤大鼠在不同时间点主要脏器(肝、肺、心、小肠)中TLR4、TNF-αmRNA的表达及病理损伤积分,探讨TLR4在严重烫伤脏器损害中的作用及其机制。 研究方法:SD大鼠64只,分组同第一部分,在不同时间点处死,留取肝、肺、心、小肠组织。HE染色观察病理改变,用病理记分法记录各脏器损害程度, RT-PCR检测TLR4、TNF-αmRNA的表达,免疫组化方法检测TLR4蛋白表达。 主要结果: 1.病理组织学改变:严重烫伤后各脏器病理改变明显,烫伤后各时间点各脏器的病理损伤积分均显著高于对照组(P0.01),其中肝脏损害出现最早,且最严重。 2.TLR4 mRNA和蛋白的表达:严重烫伤可迅速上调肝、肺、心及小肠组织TLR4 mRNA和蛋白的表达(P0.01),肝和肺8h达高峰(P0.01),心及小肠12h达高峰(P0.01),至72 h则明显降低,但仍明显高于对照组(p0.01)。 3.TNF-αmRNA的表达:大鼠肝、肺、心及小肠TNF-αmRNA表达在烫伤后各组均显著高于正常对照组(p0.01),其中在12 h达到峰值(p0.01),到72 h则明显降低,但乃明显高于正常对照组(p0.01)。 4.相关分析:肝、肺、心、小肠中TLR4mRNA与TNF-αmRNA表达呈显著正相关(p0.01);与病理损伤积分呈正相关(p0.01)。结论:严重烫伤导致多种组织TLR4持续高表达,其改变与多器官损害密切相关。 第三部分:连翘对严重烫伤大鼠TLR4表达及ET、Treg的影响及其机制 研究目的:观察连翘对严重烫伤后8h大鼠脾脏TLR4、Foxp3基因和蛋白的表达、血浆ET和Treg水平的变化及对LPS诱导巨噬细胞(RAW264.7)16h后TLR4和TNF-αmRNA表达的影响,探讨连翘抗内毒素作用、免疫调节作用及其可能机制。 研究方法:体外实验共分6组,分别为control组,LPS组,连翘高、中、低剂量组(AFS1+LPS、AFS2+LPS、AFS3+LPS)及多黏菌素B组(Ploy B+LPS);AFS1+LPS、AFS2+LPS、AFS3+LPS和Ploy B+LPS组分别加入连翘水煎液(AFS)50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml及Ploy B 10ug/ml培养0.5h后,再加入10ng/mlLPS,培养16h;两个体内实验分别分6组和5组,其中AFS1、AFS2和AFS3组在烫伤前7天开始灌胃给药,每天一次,分别给予AFS 5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg。MTT法检测各组细胞存活率;RT-PCR法检测各组细胞、脾脏组织的TLR4、TNF-α、Foxp3mRNA含量变化;Western blot法测各组细胞、脾脏组织TLR4蛋白表达变化;流式细胞术检测Treg百分数;鲎试剂法测血浆内毒素含量;免疫组化方法检测各组脾脏组织Foxp3蛋白表达。 主要结果: 1.连翘对LPS作用的巨噬细胞TLR4信号通路的影响 1.1MTT法检测显示:与control组比较,LPS(10ng/ml)组细胞存活率显著下降;AFS1、AFS2、AFS3剂量预处理均能明显提高细胞存活率( P0.01),并呈剂量依赖关系;AFS1+LPS组与Ploy B+LPS组比较无显著性差异。 1.2 TLR4 mRNA和蛋白的表达:control组RAW264.7细胞只表达少量TLR4,给予LPS刺激16h, TLR4表达明显升高(P0.01),AFS1、AFS2、AFS3预处理均可明显降低TLR4的表达,并呈剂量依赖关系;AFS1+LPS组与Ploy B+LPS组比较无显著性差异。 1.3 TNF-αmRNA的表达:control组RAW264.7细胞只表达少量TNF-αmRNA,给予LPS刺激16h, TNF-αmRNA表达明显升高(P0.01),AFS1、AFS2、AFS3预处理均可明显降低TNF-αmRNA的表达,并呈剂量依赖关系;AFS1+LPS组与Ploy B+LPS组比较无显著性差异。 2.连翘对严重烫伤大鼠血浆ET及脾脏TLR4的影响与control组比较,烫伤后8小时组(Post burn hour,8PBH)脾脏组织TLR4 mRNA和TNF-αmRNA表达明显上调,血浆ET水平显著升高,TLR4蛋白的变化与TLR4 mRNA基本一致;AFS1、AFS2及AFS3组均能显著减轻上述指标变化,并呈剂量依赖关系,AFS1组与Ploy B组比较无显著性差异。 3.连翘对严重烫伤大鼠外周血Treg及脾脏Foxp3的影响与control组比较,8PBH组脾脏组织Foxp3mRNA和蛋白表达明显上调,血浆Treg水平显著升高;AFS1、AFS2及AFS3组均能显著减轻上述指标变化,并呈剂量依赖关系。 结论:连翘预处理能抑制LPS作用的巨噬细胞RAW264.7内TLR4的上调;灌胃给药可降低严重烫伤后大鼠外周血ET、Treg水平,并可使严重烫伤后高表达的TLR4下调,从整体、细胞和水平证实了连翘具有抗内毒素作用和免疫调节作用。


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