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人表皮干细胞定位、分离培养与端粒酶表达的实验研究

黄培信  
【摘要】: 一、研究目的 (1)研究不同发育阶段人表皮干细胞定位与端粒酶表达特征,探讨这些特征对烧伤创面修复的临床意义。 (2)研究人表皮干细胞的体外分离培养及鉴定方法,比较在体外培养条件下不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶活性表达差异,为表皮干细胞在皮肤组织工程中的应用奠定基础。 二、研究方法 第一部分表皮干细胞的定位与端粒酶表达检测 取因创伤等原因致意外流产的胎儿皮肤和少儿、成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,取材后立即用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4℃保存待测。所有标本经系列切片后,分别采用鼠抗人整合素β1(integrinβ1)、角蛋白19 (keratin19,K19)、p63转录因子(p63 transcription factor)、端粒酶逆转录酶催化亚基(telomerase reverse transcriptase catalytic subunit,TERT)单克隆抗体作为一抗,以免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织中表皮干细胞标志物整合素β1、角蛋白19、p63转录因子和TERT的表达,200倍光镜下观察免疫组化结果,测定阳性表达率。 第二部分表皮干细胞的分离培养、鉴定及端粒酶活性表达检测 取因创伤等原因致意外流产的胎儿皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原快速粘附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成的人表皮干细胞培养基进行体外培养。通过计算其克隆形成率、细胞周期测定及免疫细胞化学染色法β1整合素、K19、p63单抗检测等对培养细胞进行鉴定。均以角质细胞作对照。以免疫细胞化学染色法和图像分析法检测体外培养的胎儿皮肤、少儿皮肤和成年人皮肤表皮干细胞端粒酶活性表达。 三、研究结果 第一部分 胎儿皮肤、少儿皮肤和成年人皮肤表皮的基底部、毛囊周围细胞均可见β1整合素、K19、p63和TERT呈棕黄色阳性表达。胎儿表皮基底层细胞β1整合素、K19和p63均为强阳性;少儿表皮基底层细胞中大部分细胞表达β1整合素、K19和p63阳性细胞均匀分布;成年人表皮基底层β1整合素、K19和p63弱阳性表达,阳性细胞散在分布,且呈相对集中片状分布,阳性细胞表达强度较胎儿组、少儿组低。 胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤端粒酶免疫组化染色均呈阳性,阳性细胞主要集中于表皮基底层。其中,胎儿表皮基底层阳性细胞表达强度较少儿表皮和成人表皮强,少儿次之,成人表皮表达最弱。 胎儿皮肤、少儿皮肤与成年人皮肤β1整合素、K19、p63和TERT阳性表达率均随年龄增加而呈下降趋势,组间差异有非常显著性意义(P0.01)。 第二部分 分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,其克隆形成率明显高于对照组,组间差异有显著性意义(P0.05)。细胞周期检测发现,人表皮干细胞G0/G1期细胞比例明显高于角质细胞组,组间差异有显著性意义(P0.05)。免疫细胞化学检测显示,分离培养的人表皮干细胞β1整合素、K19和p63呈阳性表达,角质细胞对照组表达阴性。 分离培养的人胎儿皮肤来源表皮干细胞、少儿皮肤来源表皮干细胞、成人皮肤来源表皮干细胞端粒酶活性表达均呈阳性。但表达强度不同,其表达强弱依次人胎儿皮肤来源表皮干细胞、少儿皮肤来源表皮干细胞、成人皮肤来源表皮干细胞。图像分析法检测各组细胞平均吸光度值和阳性面积值,结果显示:胎儿组、少儿组、成人组表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,组间差异有显著性意义(P 0. 05)。 四、研究结论 (1)胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮干细胞主要位于表皮基底层,端粒酶表达阳性区域及信号强度与表皮干细胞的定位分布及阳性表达强度相一致。提示表皮干细胞的数量、端粒酶活性表达的强弱可能与不同发育阶段皮肤组织的修复能力差异密切相关。 (2)本实验采用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮、用Ⅳ型胶原快速粘附法分离培养人表皮干细胞,细胞呈明显克隆性生长,G0/G1期细胞比例高,β1整合素、K19和p63免疫细胞化学染色均呈阳性表达。表明在本实验培养条件下分离培养的人表皮干细胞具有干细胞的生物学特性。 (3)体外培养的人胎儿期、少儿期、成人期表皮干细胞均有端粒酶活性表达,其表达强弱依次为人胎儿皮肤来源表皮干细胞、少儿皮肤来源表皮干细胞、成人皮肤来源表皮干细胞。提示诱导和增强端粒酶活性表达对维持表皮干细胞在体外的自我更新和增殖能力可能具有重要意义。


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