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解偶联蛋白2在血管紧张素II致线粒体活性氧生成中的作用

尹康  
【摘要】: 背景:大量的研究认为:活性氧类物(reactive oxygen species,ROS),如超氧阴离子和过氧化氢等)参与多种病理生理过程,包括内皮舒张功能减退,系统性高血压,细胞凋亡和炎症反应以及触发细胞内信号转导途径,参与许多疾病包括心血管疾病、神经变性、炎性疾病及感染;ROS在血管紧张素II(AngII)参与的病理生理活动中起重要的作用;解偶联蛋白2(Uncoupling protein-2,UCP2)属线粒体阴离子携带者一大家族的成员之一,研究表明UCP2可以通过使氧化磷酸化与ATP合成解偶联而降低线粒体内膜电势,从而抑制ROS的生成。 目的:观察血管紧张素II(AngII)对内皮细胞线粒体膜电位和活性氧的影响,探讨解偶联蛋白2(UCP2)在该途径中的作用 方法:实验共分三部分。(1)为了观察AngII对内皮细胞活性氧生成的影响,按干预浓度分为四组:对照组(DMEM培养基),AngII0.1μmol/L组,AngII1μmol/L组,AngII10μmol/L组分别与HUVEC(原代培养的人脐静脉内皮细胞)共同孵育24小时,RT-PCR法定量UCP2mRNA表达,DCFH-DA检测线粒体活性氧(流式细胞仪法),罗丹明123检测线粒体膜电位(流式细胞仪法); (2)为了观察UCP2对内皮细胞活性氧的影响,首先通过UCP2反义寡核苷酸降低UCP2表达,实验分组:对照组(DMEM培养基),UCP2反义寡核苷酸(浓度10μmol/L)组,UCP2错义寡核苷酸(浓度10μmol/L)组,然后用外源性解偶联剂增加内皮细胞解偶联活性,实验分组:对照组(DMEM培养基),AngII1μmol/L组,CLCCP(100μmol/L)+ AngII1μmol/L组,助溶剂DMSO100μmol/L+ AngII1μmol/L组,分别与HUVEC共培养24小时,DCFH-DA检测线粒体活性氧,罗丹明123检测线粒体膜电位。(3)观察氧化剂对UCP2的影响,实验分组:对照组(DMEM培养基),H2O2100μmol/L组,H2O250μmol/L组与HUVECs共培养24小时,RT-PCR法定量UCP2mRNA表达。 结果:用10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L的AngII处理HUVEC24小时后1)流式细胞仪测线粒体膜电位(罗丹明123染色)的平均荧光强度分别为418.1±5.8,354.1±4.2,267.6±10.6(各组间比较p均0.01)。流式细胞仪测活性氧(DCFH-DA法)的平均荧光强度是365.3±5.2,258.2±4.8,188.6±12.6(各组间比较p均0.01),2)UCP2mRNA表达(灰度值)分别是0.450±0.024, 0.436±0.018, 0.381±0.020,1μmol/L组比0.1μmol/L组表达增加极显著(p0.01), 10μmol/L组比1μmol/L组表达增加显著(p0.05),即UCP2随AngII的浓度升高而表达增加;用UCP2反义寡核苷酸(浓度10微摩尔/升)与HUVEC共培养24小时后,与对照组相比,活性氧升高83%(p0.01),线粒体膜电位升高64%(p0.01), CLCCP(浓度100微摩尔/升)与HUVEC共培养24小时后,与对照组相比,活性氧下降26%(p0.01),线粒体膜电位下降28%(p0.01);此外用浓度为100微摩尔/升和50微摩尔/升的H2O2干预HUVECs24小时,UCP2mRNA表达为0.412±0.026和0.393±0.018,50μmol/L组比对照组表达增加极显著(p0.01), 100μmol/L组比50μmol/L组表达增加显著(p0.05),即UCP2随H2O2的浓度升高而表达增加。 结论:AngII增加线粒体活性氧的产生,上调UCP2的表达;降低UCP2的表达使活性氧生成增加,增加线粒体解偶联活性(CLCCP)使线粒体活性氧生成减少,提示AngII可能通过影响UCP2的表达从而影响线粒体活性氧的生成,也即UCP2具有抗氧化作用,通过提高解偶联蛋白2的表达从而减轻氧化应激可能是细胞抗氧化的重要机制。


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