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橙色红曲菌ACS基因和GMC基因缺失菌株的构建及其功能分析

阮琼芳  
【摘要】: 红曲菌是我国重要的微生物资源,能够产生多种具有生物活性的代谢产物,具有很高的商业价值。但是由于红曲菌产桔霉素问题的存在,对红曲的安全性提出了怀疑。 本文采用分子生物学技术,初步研究了酰基辅酶A合成酶(Acyl-CoA synthetase,以下简称ACS)和GMC氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductase,以下简称GMC)编码基因的生物学功能,为阐明桔霉素代谢途径提供理论依据。主要研究内容如下: 1 Blast比对分析,预测ACS基因为酰基辅酶A合成酶的编码基因,GMC基因为芳香醇脱氢酶的编码基因,推测ACS和GMC基因可能参与桔霉素生物合成途径。 2通过酶切、连接和转化等DNA重组技术,成功构建了置换型打靶载体pACS-HPH和pGMC-HPH,载体中含有潮霉素抗性标记。 3采用原生质体PEG介导转化将置换型打靶载体pACS-HPH和pGMC-HPH分别转入橙色红曲菌。AS3.4384中,采用潮霉素抗性筛选和基因组DNA的PCR筛选,分别获得ACS-6和GMC-8红曲菌缺失菌株。 4采用HPLC分别检测ACS-6和GMC-8缺失菌株中桔霉素和红曲色素两种次级代谢产物的含量,验证以上两个基因的生物学功能,提示ACS基因参与桔霉素和红曲色素代谢过程中聚酮链骨架及十酰辅酶A的合成,GMC基因参与桔霉素和红曲色素的PKS后修饰过程。


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