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GL-7-ACA酰化酶基因工程菌的发酵工艺优化及酶工程研究

杨志平  
【摘要】: GL-7-ACA酰化酶(EC.3.1.5.11)是两步酶法催化CPC生产7-ACA的重要工业用酶之一,它的表达量和酶活性的增加是提高7-ACA产量的前提。重组大肠杆菌E. coliBL21(DE3)pYW-GA表达GL-7-ACA酰化酶呈组成型表达,其高效表达的关键技术是补料策略。 本文探索了组成型重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pYW-GA高效表达的发酵工艺。在摇瓶培养获得GL-7-ACA酰化酶工程菌的最佳发酵条件的基础上,用5L自控式发酵罐进行分批补料培养。为了减少基因工程菌代谢过程中乙酸的积累,使GL-7-ACA酰化酶基因获得高效表达,发酵过程中采用不同的流加方式进行补料,同时对转速和溶氧等进行控制。考察了恒速流加、pH反馈流加和指数流加三种补料模式,比较得出菌浓最高的是pH8.0反馈流加这一模式,OD_(600)可达35,而酶活最高的模式是pH7.0反馈流加,最高酶活可达3463.8U/L。 固定化金属亲和层析技术以其分离蛋白专一性强而得到广泛应用,本文以EIP-ARG-IDA-Co~(2+)为载体,从可溶性总蛋白中一步分离纯化具有His-tag标签的GL-7-ACA酰化酶。在此基础上进行了固定化方面的研究,确定固定化最适条件是150~200U/g给酶量与载体比,固定化时间16h,固定化介质pH7.0。固定化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0。同时还考察了固定化酶的热稳定性,重复利用性及载体的重复使用等特性。 大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pYW-GA高效表达GL-7-ACA酰化酶的发酵工艺及其固定化方法的建立为工业化生产GL-7-ACA酰化酶和两步酶法生产7-ACA奠定了基础。


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