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TLR/NF-κB信号通路与其负性调控因子SIGIRR和IBD的关系

黄庆伦  
【摘要】: 研究目的: 探讨TLR/NF-κB信号通路在IBD致病中的作用及其抑制因子SIGIRR对LPS/TLR致炎信号通路负性调控的作用机制。为IBD的治疗提供新的靶点和方向。 研究方法: ⑴TLR4/NF-κB信号通路在溃疡性结肠炎患者肠黏膜中的变化及其相互之间关系的研究:采用SP免疫组化二步法检测了68例内镜活检的肠黏膜内TLR4和NF-κBP65的表达。68例包括:UC 53例(根据Tmelove-Richards分级分为:Ⅰ级9例,Ⅱ级15例,Ⅲ级19例)及正常对照者15例。 ⑵SIGIRR对巨噬细胞LPS/TLR信号通路的影响:①以未转染SIGIRR基因的巨噬细胞株Raw264.7为SIGIRR低表达株,采用脂质体转染技术将pUNO-mSIGIRR转入Raw264.7细胞,构建SIGIRR高表达细胞株;②分以下6组:对照组1:Raw264.7;对照组2: Raw264.7 + pUNO(空质粒);对照组3: Raw264.7 cell + pUNO-mSIGIRR;实验组1:Raw264.7 cell +LPS;实验组2: Raw264.7 + pUNO (空质粒) + LPS;实验组3 : Raw264.7 cell + pUNO-mSIGIRR + LPS;实验组在质粒转染后,加入10ng/ml LPS培养12h;③用RT-PCR方法检测各组细胞SIGIRR、TLR2、TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6 mRNA的表达。 研究结果: ⑴TLR4/NF-κB信号通路在溃疡性结肠炎患者肠黏膜中的变化及其相互之间关系的研究:①TLR4和NF-κB P65在UC患者肠黏膜中的表达分别为50/53(94.3%)和46/53(86.8%)显著高于正常对照者的6/1(540%)和5/15(33.3%)(P0.01),并且随着病变严重程度加重而增高;②UC患者肠黏膜内TLR4和NF-κB p65的表达呈显著正相关(r =0.923,P0.01)。 ⑵SIGIRR对巨噬细胞LPS/TLR信号通路的影响:①转染了SIGIRR的Raw264.7细胞内SIGIRR mRNA的表达为0.470±0.045显著高于未转染和转染空质粒的Raw264.7细胞(0.210±0.021,0.212±0.027,P0.001)。②无论是转染了还是未转染SIGIRR的Raw264.7细胞,经LPS作用后其SIGIRR mRNA的表达均显著低于对照组(0.114±0.052 vs 0.210±0.021, 0.109±0.047 vs 0.212±0.027, 0.302±0.036 vs 0.470±0.045)(P0.001)。③LPS对转染和未转染SIGIRR的Raw264.7细胞TLR2 mRNA的表达均无影响(0.222±0.037 vs 0.218±0.036, 0.220±0.039 vs 0.215±0.035, 0.217±0.032 vs 0.205±0.029)(P0.05);同时SIGIRR对Raw264.7细胞内TLR2 mRNA的表达也无影响(P0.05);④无论是转染了还是未转染SIGIRR的Raw264.7细胞,经LPS作用后其TLR4 mRNA的表达均显著高于对照组(0.587±0.103 vs 0.309±0.046 , 0.564±0.092 vs 0.291±0.050, 0.558±0.085 vs 0.210±0.062)(P0.001);SIGIRR对Raw264.7细胞内TLR4 mRNA的表达无影响(P0.05);⑤未转染SIGIRR的Raw264.7细胞,经LPS作用后其MyD88 mRNA的表达均显著高于对照组(0.509±0.134 vs 0.890±0.144, 0.480±0.134 vs 0.974±0.166)(P0.001),而转染SIGIRR的Raw264.7细胞其MyD88 mRNA的表达在两组之间无显著差异(0.478±0.151 vs 0.341±0.130)(P0.05)。在LPS作用组转染了SIGIRR的Raw264.7细胞其MyD88 mRNA的表达(0.341±0.130)显著低于未转染(0.890±0.144)和转染空质粒(0.974±0.166)的Raw264.7细胞(P0.001),但在对照组SIGIRR对MyD88 mRNA的表达无影响(0.509±0.134, 0.480±0.134, 0.478±0.151)(P0.05);⑥未转染SIGIRR的Raw264.7细胞,经LPS作用后其IRAK1 mRNA的表达均显著高于对照组(0.964±0.208 vs 0.522±0.096, 1.042±0.256 vs 0.491±0.121)(P0.001),而转染SIGIRR的Raw264.7细胞IRAK1 mRNA的表达在两组之间无显著差异(0.440±0.114 vs 0.530±0.134)(P0.05);在LPS作用组转染了SIGIRR的Raw264.7细胞其IRAK1 mRNA的表达(0.440±0.114)显著低于未转染(0.964±0.208)和转染空质粒(1.042±0.256)的Raw264.7细胞(P0.001),但在对照组SIGIRR对IRAK1 mRNA的表达无影响(0.522±0.096, 0.491±0.121, 0.530±0.134)(P0.05);⑦无论是转染了还是未转染SIGIRR的Raw264.7细胞,经LPS作用后其TRAF-6 mRNA的表达均显著高于对照组(0.458±0.039 vs 0.263±0.051, 0.444±0.049 vs 0.268±0.043, 0.320±0.061 vs 0.247±0.034) (P0.001或P0.01);在LPS作用组转染了SIGIRR的Raw264.7细胞其TRAF-6 mRNA的表达(0.320±0.061)显著低于未转染(0.458±0.039)和转染空质粒(0.444±0.049)的Raw264.7细胞(P0.001),但在对照组SIGIRR对TRAF-6 mRNA的表达无影响(0.263±0.051, 0.268±0.043, 0.247±0.034)(P0.05)。 结论 1、UC患者肠黏膜TLR4和NF-κB p65的表达均显著上调,这可能增加肠上皮细胞、固有层单个核细胞对肠腔内的细菌和内毒素的敏感性,产生过激的免疫炎症反应,导致IBD的发生。 2、UC患者肠黏膜TLR4和NF-κB p65的表达随着患者肠黏膜病理分级加剧而增加,提示TLR4/ NF-κB通路参与了UC的发生发展。 3、LPS可显著抑制巨噬细胞Raw264.7内SIGIRR的表达,同时上调TLR4和其信号通路的下游分子(MyD88、IRAK-1和TRAF6)的表达。 4、给予外源性SIGIRR基因可阻断LPS对TLR信号通路的激活,下调MyD88、IRAK-1和TRAF6的表达,这可能是其对TLR信号通路的负性调控机制之一。 5、给予外源性SIGIRR基因对无LPS作用的巨噬细胞Raw264.7的TLR信号通路无影响,但是可阻断LPS对TLR信号通路的激活,从而抑制LPS诱导的免疫炎症反应,因此,SIGIRR有望作为IBD乃至其它炎症性疾病的治疗靶点。


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