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骨髓间充质干细胞移植促进脑缺血皮质区血管新生的机制研究

吕世刚  
【摘要】: 研究背景和目的: 缺血性脑卒中是临床常见疾病之一,死亡率和致残率均较高。缺血性脑卒中发生后,缺血区神经元因缺血、缺氧而发生死亡,及时重建缺血区血运是脑缺血损伤治疗的关键之一。动物实验和临床研究均表明脑缺血后缺血区域有代偿性血管新生现象,它们对于增加脑缺血区血液灌注量和限制缺血半影区面积的扩散有着积极的作用。近年来,有研究表明通过移植骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)可促进脑缺血区的血管新生和受损神经功能的恢复,然而其机制目前尚不清楚。研究证实Notch信号通路在胚胎血管发育和肿瘤血管新生过程中起着重要的调控作用,但Notch信号通路是否参与脑缺血后血管新生的调控尚待研究证实。本课题拟通过观察MSCs移植后脑缺血区血管新生情况及Notch信号分子在该过程中的表达变化,探讨Notch信号通路在MSCs移植后促进脑缺血区血管新生过程中的作用及调控机制,为将来利用MSCs移植治疗缺血性脑卒中的临床应用提供理论依据。 研究内容和方法: 1.采用贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠MSCs,收集第四代MSCs用于移植实验。 2.SD大鼠随机分为MSCs移植组、缺血对照组和正常组,前两组采用线栓法制作大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAo)脑缺血模型,正常组大鼠不予手术处理。于缺血24小时后MSCs移植组经股静脉移植MSCs,缺血对照组则注射等体积的0.01M PBS。在移植后1、3、7、14和21天分批处死各组大鼠,取脑组织标本待检。 3.免疫组织荧光染色后镜下观察移植的MSCs在缺血侧和健侧脑组织的分布并计数。 4.脑组织标本冰冻切片行Ⅷ因子免疫组织化学荧光染色,×400下计数各组脑缺血皮质区微血管数量。 5.取各组脑组织标本冰冻切片行VEGF免疫组织化学荧光染色,×400下计数各组缺血皮质区VEGF阳性细胞数量;RT-PCR方法检测各组缺血皮质区VEGF165mRNA的表达水平。 6.取各组脑组织标本冰冻切片行Ⅷ因子和Notch1双重免疫组织荧光染色,×400下计数各组缺血皮质区Notch1表达阳性的微血管数量。Westernblot方法同时检测各实验组缺血皮质区Notch1蛋白表达情况。RT-PCR方法则检测各实验组缺血皮质区Notch1mRNA和Hes1mRNA的表达水平。 结果: 1.培养第四代的MSCs为均一的“纺锤形”,呈漩涡样生长,细胞荧光化学染色为CD29(+)、CD34(-),符合大鼠MSCs的特征。 2. MSCs移植1天亚组可见移植MSCs主要分布在脑组织缺血侧,缺血侧和健侧脑组织内MSCs计数分别为7.96±1.28和3.07±0.77,P0.05,表明MSCs经股静脉移植后可在短时间内迁移到脑缺血区域。 3.各实验组1、3、7、14和21天亚组缺血皮质区微血管计数:MSCs移植组为3.96±0.33、4.68±0.64、9.26±1.62、8.88±1.34和6.98±1.54;缺血对照为2.85±0.51、4.47±0.44、5.63±0.69、4.09±0.44和3.75±0.72;正常组为2.79±0.21。双重荧光染色发现缺血皮质区部分Ⅷ因子阳性细胞同时表达CM-DiⅠ,结果表明MSCs移植可明显增加脑缺血皮质区新生血管的数量,部分血管内皮细胞来自于移植的MSCs。 4.各实验组1、3、7、14和21天亚组缺血皮质区VEGF阳性细胞计数:MSCs移植组为6.98±0.54、9.15±1.13、11.14±0.98、9.13±0.35和8.85±0.53;缺血对照为3.66±0.55、4.62±0.32、5.88±0.62、5.11±0.26和3.99±0.32;正常组为2.46±0.24。RT-PCR结果示MSCs移植组各时间点缺血皮质区VEGF165表达水平明显高于同时间点缺血对照组和正常组(P0.05),表明MSCs移植可上调缺血皮质区VEGF蛋白和VEGF165基因的表达。 5.各实验组1、3、7、14和21天亚组缺血皮质区Notch1阳性表达微血管计数:MSCs移植组为3.30±0.26、3.73±0.25、6.85±0.38、3.78±0.59和0.49±0.25;缺血对照组为2.57±0.24、1.78±0.28、0.61±0.14、0.05±0.05和0.02±0.02;正常组大脑皮质区无Notch1阳性的微血管。Western blot结果示MSCs移植组各时间点缺血皮质区Notch1电泳条带灰度值均较高于缺血对照组。RT-PCR结果则显示MSCs移植组各时间点缺血皮质区Notch1、Hes1表达水平明显高于缺血对照组和正常组(P0.05)。表明MSCs移植能促进缺血皮质区血管内皮细胞上Notch1蛋白、Notch1mRNA和Hes1mRNA的表达。 结论: 1. MSCs经股静脉注射移植后,可趋向性迁移到脑缺血区域,并可参与和促进缺血区新生血管的形成。 2. MSCs移植可通过促进缺血皮质区VEGF的表达,激活血管内皮细胞的Notch信号通路,从而促进缺血区血管新生。结果表明Notch信号通路参与了脑缺血后缺血区血管新生过程的调控。


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