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沉香内生真菌的初步研究

冯乃宪  
【摘要】: 内生真菌(Endophytic fungi)是一大类未被充分研究的真菌。近年来的研究表明,几乎所有植物中都存在内生真菌,他们主要生长在植物的根、茎、叶等器官的表皮下的组织当中。它泛指那些生活在健康的植物体内不引起任何病害症状的所有真菌,植物内生真菌长期生活在稳定的植物微生态系统中,和宿主建立了共生或半共生关系。研究表明已分离出的大多数植物内生真菌能够产生与其宿主相同或相似的活性成分。 白木香树的茎干在刀砍、虫蛀、病腐后被真菌感染,木质部的薄壁细胞中储存的物质产生一系列化学变化,最后形成树脂,即为沉香。为了找出含有树脂的木材,必须砍倒树干才能找出含有沉香树脂的个体,导致大量白木香树遭人砍伐,严重影响了白木香族群的生存。同时,沉香的高价也导致了白木香在多个沉香产地国被非法砍伐及贸易。因此,从沉香木块中分离沉香内生真菌研究人工结香具有重要的意义。 本论文通过优化内生真菌的分离条件,从沉香木块中分离纯化出9株沉香内生真菌,然后通过苄基丙酮耐受性、人工结香材料分析等方法筛选出4株内生真菌具有促进结香作用;对该4株内生真菌进行分子生物学种属鉴定、人工结香条件实验和红褐肉座菌摇瓶发酵实验。实验结果概括如下: 1、沉香内生真菌分离条件优化实验中,采用次氯酸钠(5%有效氯)作为表面消毒剂处理效果较好,选择次氯酸钠(5%有效氯)消毒合适的时间为4min,最适分离培养温度是26℃。共分离纯化出9株沉香内生真菌,经初步鉴定分属2亚门、5目、5科、5属。 2、对沉香挥发油提取方法进行方法学研究,选择索氏提取无水乙醚回流法结合GC-MS分析沉香挥发油成分组成。 3、沉香内生真菌的筛选实验中,先后通过苄基丙酮耐受性筛选、人工结香样品变色部分的宽度和燃烧香味筛选,最后筛选出Aq-2、Aq-3、Aq-5b、Aq-7等4株内生真菌。 4、沉香内生真菌的分子生物学种属鉴定,鉴定结果为:Aq-2为蒂腐色二孢(Botryosphaeria rhodina),Aq-3为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina),Aq-5b里氏木霉(Trichoderma reesei),Aq-7为康氏木霉(Trichoderma koningii)。 5、对4株沉香内生真菌蒂腐色二孢、红褐肉座菌、里氏木霉、康氏木霉按照封口方式、打孔位置、接菌方式、结香时间等方案进行人工结香条件研究。最适结香条件:采用棉塞和木塞作为封口方式;选择树干自基部50~100cm之间的区域作为结香位置;采用蒂腐色二孢菌株单菌结香和褐肉座菌、里氏木霉、康氏木霉3株木霉属内生真菌混菌结香,其次是里氏木霉、康氏木霉混合人工结香等作为人工结香方式;适当延长接菌时间,可以得到品质好的沉香。 6、红褐肉座菌摇瓶发酵液和菌体内含物GC-MS的检测实验,在发酵液成分中未发现苄基、呋喃基等基团的成分存在,菌体内含物中检测出苯吡喃类化合物,属于沉香复杂成分中的一种,但是该化合物的含量非常少,而且成分也比较单一,采用微生物发酵产沉香物质的可行性受到限制。


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