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1、红曲菌两种新的荧光代谢产物的研究 2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇胶体金免疫层析试纸条的研制

黄志兵  
【摘要】: 红曲在我国古代也称“丹曲”,传统的红曲是指以大米为原料,接种红曲菌经固体发酵而成的红曲米。红曲在中医上具有健脾化食、燥湿化痰、活血化瘀等功效;工业上常用于制作红曲米酒和腌渍肉、鱼等。红曲中含有多种代谢产物,例如醇类物质、酶类物质、有机酸、红曲色素、莫纳可林K(Monacolin K,MK)、γ-氨基丁酸(GABA)等。其中大部分代谢产物具有降血压、降血脂、抗菌、抗氧化和抗癌等重要的生理活性。红曲菌发酵代谢产物成分复杂,虽然已有较多代谢产物被分离和鉴定,如红曲色素、MK、桔霉素等,但有关红曲中荧光物质的报道甚少。 本论文的第一部分分离和鉴定了红曲中两种新的荧光物质,并对其部分性质进行了研究。主要研究及结果如下: 1采用硅胶柱层析和半制备型HPLC首次分离、纯化得到了红曲中两种新的荧光物质。两者的紫外吸收光谱相似,分子量分别为356和384,命名为monasfluore A(MFA)和monasfluore B(MFB)。分别对MFA和MFB进行荧光光谱扫描,确定了两者的最佳激发波长和发射波长分别为λex=396 nm和λem=460 nm。采用UV、HPLC、LC-MS、LC-MS/MS、HRMS和NMR等手段对MFA和MFB的结构进行了表征。结果发现MFA为MFB类似物,两者的基本骨架完全相同,具有相同的多聚酮发色团结构,两者之间分子量相差28,只是侧链相差两个亚甲基,MFA含有6个碳原子的己基侧链,而MFB含有8个碳原子的辛基侧链。这与已知结构的6种红曲色素相类似,也属于Azaphilones类代谢产物。 2首次建立了用HPLC同时测定红曲样品中MFA和MFB的方法。采用色谱柱Symmetry C_(18)(5μm,250×4.6 mm I.D.)和乙腈-水(77:23,v/v)流动相作为分离条件;λex=396 nm,λem=460 nm作为荧光检测器的检测波长,以自制的MFA和MFB为对照品进行定量分析。其中MFA的线性方程为Y=772.5X-289.2,相关系数R=0.9994,线性范围为0.5-10 ng/mL,平均回收率为85.2%,相对标准偏差为4.2%;MFB的线性方程为Y=2376.6X+1346.4,相关系数R=0.9972,线性范围为0.25-5 ng/mL,MFB的平均回收率为82.3%,相对标准偏差为5.3%。多次测定的相对标准偏差均小于3%,具有较好的重复性和稳定性。采用建立的HPLC方法检测了经20株红曲菌发酵的大米,结果发现不同红曲菌株发酵的大米中,MFA和MFB的含量不一,其中含量最高的为13号菌,MFA和MFB的含量分别为81.4 g/kg和26.3 g/kg,而14号菌发酵的大米中的MFA和MFB含量最低,分别为0.01 g/kg和0.003 g/kg。 3首次对MFA和MFB的强酸和强碱、热稳定性、光稳定性和与BSA相互作用进行了研究。结果发现,MFA和MFB的热稳定性和光稳定性差,在酸性条件下比碱性条件稳定。与MFA相比,MFB与BSA的作用力明显增强,可能是由于MFB含有更长的侧链,具有更强的亲脂性,与BSA之间的疏水作用更强。 4采用MTT法首次研究了MFA和MFB对人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(HepG2)和人二倍体细胞(WI-38)增殖的抑制作用,结果发现MFA和MFB对A549和HepG2细胞有较明显的抑制作用,而对WI-38细胞抑制相对较弱。MFA和MFB对HepG2细胞抑制的IC_(50)值分别为12.4和7.1μg/mL;MFA和MFB对A549细胞抑制IC_(50)值分别为16.3和10.6μg/mL。MFB对细胞抑制的作用明显强于MFA,提示可能与两者的侧链长度不同有关。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是一种常见的真菌毒素,广泛存在于小麦和玉米等谷物及其制品中,对人类和动物构成很大的威胁。目前,有关DON的检测方法主要有薄层层析法、气相色谱法(采用电子捕获检测器或质谱检测)、液相色谱法(采用紫外、荧光、质谱或质谱-质谱检测)和ELISA等。上述方法不仅检测设备昂贵、样品前处理复杂、耗时费力,而且需要专业人员操作,难于在基层普及和推广,更不适合现场和野外大规模的快速检测。 本研究第二部分研制了谷物及其制品中DON的胶体金免疫层析快速检测试纸条。该试纸条准确灵敏、特异性好、操作简单、快速,无需昂贵的设备,适合于现场和批量样品的检测分析。主要研究及结果如下: 1对金标抗体的制备的主要影响因素进行了研究。采用ELISA测定标记的金标抗体离心后的上清液与参照液中抗体含量,确定了胶体金最佳标记pH值为7.0;采用盐析滴定法确定了制备金标抗体最适标记抗体量为30μg/mL。 2优化了试纸条的工艺条件。选用P40膜作为层析膜;金标抗体的稀释度为1:3(即稀释3倍);P40膜上喷有浓度分别为800μg/mL和1 mg/mL的检测抗原(DON-CBSA)和羊抗鼠IgG二抗,喷量均为0.74μL/cm;在上样液中加上0.005%的阴离子表面活性剂,能很好的消除试纸条上金标抗体与检测抗原之间由于静电作用而产生的非特异性吸附。 3该试纸条的灵敏度较高,为50 ng/mL;特异性较好,该试纸条与黄曲霉毒素B_1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素和桔霉素未见有交叉反应;稳定性较好,25℃至少可保存5-6个月。 4对样品前处理进行了研究。结果发现,在本实验中样品颗粒大小、不同水质、搅拌时间和不同静置时间等对试纸条的检测结果无明显影响。考虑到现场快速检测情况,称取粉碎1-2 min后的样品5 g,加入100 mL纯净水或自来水提取,用玻璃棒剧烈搅拌2 min,静置2 min,进行检测,10 min后判读结果,整个过程只需15 min。 5采用自制的DON快速检测试纸条和Ridascreen Fast ELISA试剂盒分别检测了市售的小麦和玉米样品,对检测结果进行比较和分析,实验显示,两种方法的检测结果一致。


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