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鱼类PKZ(Protein Kinase Containing Z-DNA Binding Domain)Zα与Z-DNA的结合

吴初新  
【摘要】: 真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)激酶是在进化中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,存在于哺乳类不同的组织和细胞中,通过调节eIF2α的活性参与机体内多种应激反应。新近报道的鱼类PKZ(包括鲫鱼CaPKZ,斑马鱼DrPKZ,大西洋鲑AsPKZ和稀有鮈鲫GrPKZ)可能是继HRI、PKR、PERK和GCN2等之后的一种新的eIF2α激酶。PKZ结构独特,C端为eIF2α激酶催化区,而在其N端具有2个Z-DNA结合域(Zα)。 Z-DNA是不同于B-DNA的左手螺旋DNA,具有特殊的空间构象和重要的生物学功能。为了在体外模拟生理状态下的Z-DNA,我们构建了pMD-18T/d(GC)n(n=6,8,10,13),并利用甲基化抑制实验和抗Z-DNA抗体检测其构象。结果显示,这些插入至质粒的d(GC)n片断能够在负超螺旋维持下形成潜在的Z形构象,且其形成Z-DNA的能力依赖于d(GC)重复序列的数目。表明d(GC)n越长,形成Z-DNA的效率越高。同时,我们构建了pMD-18T/d(TA)n pMD-18T/d(non-GC-repeat)n重组质粒,同样通过抗Z-DNA抗体检测它们形成Z形构象的能力,结果发现它们均不能与抗Z-DNA抗体结合。 鲫鱼PKZ(PKR-like)是首次报道的鱼类PKZ。为深入了解鲫鱼PKZ Za的功能,本研究以pET-22b(+)为表达载体,构建了野生型pET-22b(+)/Zα1Zα2和2个替换型pET-22b(+)/Zα1Zα1、pET-22b(+)/Zα2Zα2表达质粒,并运用PCR定点突变方法构建了9个点突变型重组表达质粒(K34A, S35A, N38A, R39A, Y42A, K56A, P57A, P58A和W60A)。这些重组表达载体转化至表达菌BL21(DE3)pLysS并诱导表达,经Ni-NTA亲和层析获得各种纯化的融合多肽。 非变性PAGE电泳分析了野生型PZα1Zα2和替换型PZa1Zα1、PZα2Zα2蛋白的二聚化能力。结果显示,纯化的表达多肽PZα1Zα2在体外能够形成二聚体但没有多聚化现象。加入2-ME或SDS后,PZα1Zα2的二聚化则会被抑制,表明二硫键在稳定PZα1Zα2二聚体的过程中起着非常重要的作用。同时发现,pMD18-T/d(GC)6对PZα1Zα2的二聚化没有任何促进作用。与之不同,2个替换型PZα1Zα1、PZp2Zα2蛋白则没有发现的二聚化现象。 利用琼脂糖凝胶阻滞实验分别分析了不同的体外表达多肽与pMD-18T/d(GC)n等各种重组质粒的亲和性。结果显示,野生型PZα1Zα2和替换型PZα1zα1对重组质粒pMD18-T/d(GC)n具有很高的亲和性,并且后者的结合能力强于前者。若解除pMD18-T/d(GC)n的负超螺旋,它们间的阻滞效应便会消失,这表明pMD18-T/d(GC)n的Z形构象是为其负超螺旋所维持的。同时,竞争性实验表明PZα1Zα2对于重组质粒pMD18-T/d(GC)n的结合具有特异性。另一方面,替换型PZα2Zα2以及9个点突变型蛋白却丧失了对pMD18-T/d(GC)n亲和能力。 与此同时,通过琼脂糖凝胶阻滞实验还检测了PZα1Zα2与重组质粒pMD-18T/d(TA)n. pMD-18T/d(non-GC-repeat)n的亲和性。结果表明,PZα1Zα2与pMD-18T/d(non-GC-repeat)n、pMD-18T/d(TA)n的结合都很弱,尤以pMD-18T/d(TA)n表现为最弱。 另外,我们还克隆了草鱼CiPKZ全长cDNA序列及其启动子序列。序列分析表明,草鱼CiPKZ基因序列与鲫鱼CaPKZ的具有极高的同源性。RT-PCR分析结果显示,草鱼CiPKZ具有广谱的组织表达特性,Poly I:C诱导后其表达均会上调。这些结果表明,鱼类PKZ能够为病毒所诱导、并可能参与宿主细胞的免疫应答过程。


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