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动态高压微射流技术对胰蛋白酶和菠萝蛋白酶性质和构象变化的影响

张兆琴  
【摘要】: 动态高压微射流技术(Dynamic high-pressure microfluidization, DHPM)是一种新兴的非热加工技术,可以对物料进行高速剪切、高频振荡、瞬时压力降、膨爆和气穴等一系列作用,其工作压力可以在很短的时间内达到200 MPa。本课题研究了DHPM对胰蛋白酶和菠萝蛋白酶的活性、稳定性和构象变化的影响,初步探讨了性质变化与构象变化之间的关系。 以猪胰蛋白酶为对象,对其性质和构象分析表明,胰蛋白酶最适反应温度为35℃,最适pH7.6,属于碱性蛋白酶,并且具有较好的热稳定性以及碱性条件下的pH稳定性,45℃保温100min后,胰蛋白酶残留活性为86%。SDS-PAGE分析发现胰蛋白酶相对分子质量约24 kDa。游离巯基和总巯基含量分别是6.21±0.4和12.7±0.22μmol/g。DSC分析表明,胰蛋白酶变性温度为93℃。胰蛋白酶最大紫外吸收峰在280 nm,荧光吸收峰在350 nm。 通过研究DHPM对胰蛋白酶活性、反应稳定性和构象变化的影响,发现:DHPM对胰蛋白酶的活性没有显著影响,80、100和120 MPa处理后,胰蛋白酶相对活性分别保留98.5%、98.3%和97.8%。经160 MPa的高压力处理后,活性仍保留97%。DHPM显著提高了胰蛋白酶的热稳定性和pH稳定性,45℃保温100 min后,经DHPM 80 MPa处理的胰蛋白酶相对活性提高至96%;DHPM对胰蛋白酶最适pH值没有影响,然而,经DHPM 100和120 MPa处理后,胰蛋白酶在最适pH下活性有所提高,相对活性分别为102%和103%。构象变化分析发现,DHPM处理后胰蛋白酶游离巯基含量升高,总巯基含量降低,表明DHPM处理导致胰蛋白酶分子发生了去折叠。此外,红外光谱中α-螺旋强度降低也印证了上述观点。紫外吸收强度降低和荧光强度增强表明胰蛋白酶分子中酪氨酸和色氨酸残基所处的微环境发生了变化,埋藏在分子内部的疏水基团逐渐暴露。进一步采用Pymol对天然胰蛋白酶和去折叠胰蛋白酶的分子构象进行模拟,直观地显示了DHPM处理导致胰蛋白酶结构较为松散,分子发生部分去折叠。 以茎菠萝蛋白酶为原料,研究DHPM对其活性、稳定性的影响。结果显示:DHPM对菠萝蛋白酶具有钝化作用,但活力并不随着压力的升高而降低。压力为60、80、100、120 MPa时,菠萝蛋白酶的活力分别是94%、93%、98%及92%。DHPM不同压力对菠萝蛋白酶的最适反应温度的影响不同,但对最适pH值几乎没有影响。然而经DHPM 60、120 MPa处理后,菠萝蛋白酶在pH 8.0的稳定性显著增强。在pH 8.0保温40 min后,60、120 MPa处理的菠萝蛋白酶相对活力分别为85%和82%,分别比未经处理的高14%和11%。可见,DHPM 60、120 MPa处理极大地提高了菠萝蛋白酶在pH8.0时的稳定性。 DHPM对茎菠萝蛋白酶构象变化影响表明:DSC扫描发现DHPM处理后菠萝蛋白酶吸热峰消失。采用紫外光谱和荧光光谱等对DHPM处理后的菠萝蛋白酶的构象分析表明:DHPM导致菠萝蛋白酶部分去折叠,分子中(?)氨酸和色氨酸残基所处的微环境发生了变化;红外光谱结果显示:DHPM处理后菠萝蛋白酶二级或三级结构发生了变化。


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