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调控过氧化物酶体生物合成与增殖的miRNA分析与鉴定

张坤山  
【摘要】: microRNA (miRNA)是一类小分子非编码RNA,长度为17-25个核苷酸,主要在转录后水平参与基因调控。它们在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、形态建成、个体发育、激素分泌与信号转导等一系列生命活动中起重要作用。过氧化物酶体是由一层单位膜包裹的囊泡状细胞器,参与多种代谢过程,是细胞中极为重要的细胞器。过氧化物酶体的生物合成与增殖受到过氧化物酶体增殖激活物受体(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor,PPAR)和pex基因家族的调控,这些基因突变或表达异常,会导致脑肝肾综合症、新生儿脑白质营养不良等严重疾病。因此,深入研究过氧化物酶体生物合成与增殖的分子基础,揭示其调控机制,对于阐明过氧化物酶体生物合成与增殖的调控网络具有重要意义。 本研究以过氧化物酶体生物合成与增殖相关的pex基因和ppar基因的mRNA为靶分子,利用TargetScan、miRanda、MicroCosm Targets、Pictar等四种miRNA靶位点分析软件,预测可能靶向这些mRNA的miRNAs,然后用双萤光素酶报告基因法(Dual-luciferase assays system)对软件预测结果进行实验验证,结果小结如下: 1、以11个PEX家族成员(PEX1、PEX2、PEX3、PEX5、PEX6、PEX7、PEX10、PEX12、PEX13、PEX16、PEX19)和3个PPAR基因(PPARA、PPARG、PPARB)mRNA的3'UTR为靶序列,利用四种miRNA靶位点分析软件搜索可能调控这些转录物的miRNA。其中,TargetScan预测到的miRNA有175个,miRanda预测到的有384个,MicroCosm Targets预测到的有559个,Pictar预测到的有44个。在miRNA中,至少被2种以上软件预测到的有129个,被3种以上软件预测到的有26个,被4个软件预测到的有4个 在129个被2个以上软件预测到的miRNA中,可能调控PEX1的有4个,可能调控PEX3的有18个,可能调控PEX5的有22个,可能调控PEX6的有13个,可能调控PEX7的有31个,可能调控PEX12的有3个,可能调控PEX13的有7个,可能调控PEX19的有4个,可能调控PPARA的有13个,可能调控PPARG的有14个,未发现可能调控PEX1、PEX2、PEX10、PEX16、PPARB的miRNA. 2、利用miRBase数据库,分析26个至少被3个软件预测到的miRNA的保守性,发现大部分miRNA都很保守,例如mir-19a/b、mir-15a/b、mir-16、mir-29a/b等在至少20种以上的后生生物中存在。 3、通过文献挖掘,发现mir-15a、mir-16、mir-19a、mir-27a、mir-29a、mir-195、mir-301等的组织表达特异性与候选靶基因的呈正相关,因此进一步用实验方法验证这些miRNA的功能。 4、在鼠胚胎神经干细胞(mouse embryonic Neural Progenitor Cell, meNPC)中共表达候选miRNA与携带候选靶基因3'UTR序列的双萤光素酶报告基因,利用Dual-luciferase assays system,分析海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的表达水平,发现miR-19a能够下调携带有ppara-3'UTR区域的Rluc表达;mir15a和mir16-1能够下调携带有pexl3-3'UTR区域的Rluc表达;miR-29a能够下调携带有pex5-3'UTR区域的Rluc表达;miR-27a能够下调携带有pparg-3'UTR区域的Rluc表达。 以上结果提示我们,miRNA可能参与了过氧化物酶体生物合成与增殖过程的调控,并可能通过靶向转录因子ppar,从而调节脂肪细胞分化、脂类代谢、糖代谢等生命活动。 本研究为进一步探讨miRNA在过氧化物酶体的生物合成和增殖中的作用和调控机制奠定了基础,并为开发新的过氧化物酶体疾病治疗方案提供了新的思路。


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