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橙色红曲菌ctnG基因和ctnH基因缺失菌株的构建及其功能分析

吴伟  
【摘要】: 红曲菌是我国传统的食品发酵用菌,可以产生多种生物活性物质,被应用于食品、保健品和医药工业等领域。但由于红曲菌会产生桔霉素,使红曲产品的安全性受到质疑。 本文采用基因敲除技术,构建了ctnG基因红曲菌缺失菌株,为阐明桔霉素代谢途径提供理论依据。主要研究内容如下: 1、通过生物信息学分析,推测ctnG基因编码β型碳酸酐酶,ctnH基因编码短链脱氢酶,并预测ctnG和ctnH基因可能参与桔霉素的PKS后修饰过程。 2、成功构建了两端含目的基因同源臂序列、中间为潮霉素抗性基因的置换型打靶载体pCTNG-HPH和pCTNH-HPH。 3、采用原生质体PEG介导转化将置换型打靶载体pCTNG-HPH和pCTNH-HPH分别转入红曲菌AS3.4384原生质体中,采用潮霉素抗性筛选、打点杂交初筛和Southern杂交验证,最终获得3株ctnG红曲菌缺失菌株,ctnH红曲菌缺失株正在验证中。 4、采用HPLC法检测ctnG缺失菌株中桔霉素的产量,采用紫外分光光度法检测红曲色素的含量。发现3个缺失株桔霉素产量分别降低了50.3%、49.2%和50.8%,从而验证ctnG基因与桔霉素合成相关,预测ctnG基因参与桔霉素的PKS后修饰过程。


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