PCR扩增16srRNA基因以快速诊断败血症及分型细菌

【摘要】： 败血症是细菌进入血液引起的一种严重的全身感染性疾病,病情进展迅速,病死率高,早期诊断和有效的治疗对病人预后至关重要。目前败血症的确诊主要依靠血培养结果,但血培养方法阳性率低,耗时长,滞后于临床的需求,导致临床诊断困难。在治疗方面,由于不能明确病原体,也只能先期应用大量广谱抗生素治疗,导致耐药性致病菌的增加和病人负担的加重,所以快速诊断败血症并对细菌初步分型是临床亟待解决的难题。 16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌等原核生物中,但不存在于病毒、真菌等非原核生物中。16SrRNA基因高度保守,但这种保守是相对的,在其保守区之间存在9或10个变异区,可变区和保守区交叉排列组成,保守区序列在所有细菌菌种中高度一致,而可变区序列则随菌种的不同有较大的变化。本研究针对16SrRNA基因这一特点,在保守区设计通用引物,在可变区设计革兰阳性与阴性特异引物,利用PCR技术快速诊断败血症并对致病菌初步分型,为临床诊治提供病原学依据。 1.败血症的快速诊断 1.1在16SrRNA基因的保守区内设计通用引物,对引起败血症的常见细菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、腐生葡萄球菌)及阴性对照菌(新型隐球菌、白色念珠菌)和乙肝病毒进行扩增。阳性菌株均得到特异阳性条带,阴性质控未出现阳性条带。 1.2优化聚合酶链反应(PCR)方法并通过不同浓度细菌来检测方法的灵敏度,PCR方法的最低检测浓度可达到1.5×103CFU/ml,显著高于血培养方法。 1.3检测60例败血症患者及20例正常人血液标本中的16SrRNA基因,与血培养结果进行比较,PCR方法阳性率86.6%,血培养阳性率38.3%,PCR方法的阳性率明显高于血培养,结果有统计学意义(P0.01)。 1.4随机选取10份血培养阴性而PCR阳性血液标本进行测序,其中8份标本通过序列比对,鉴定出了标本中的细菌种属。 2.细菌的初步分型 2.1在16SrRNA基因的可变区分别设计革兰阳性菌和革兰阴性菌特异性引物,分别对革兰阳性菌株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肠球菌)和革兰阴性菌(大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌)进行巢式PCR得到特异性条带。 2.2对20例血培养阳性血液标本进行检测,得到的结果与血培养鉴定结果一致。 本研究结果表明,利用PCR扩增16SrRNA基因保守区可以快速诊断败血症,其阳性率明显高于血培养方法,分别用革兰阳性和革兰阴性引物进行巢式PCR,可快速鉴定出革兰阳性菌和革兰阴性菌,及时为临床治疗提供病原学依据。