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宿主蛋白GM130在CVB3病毒性胰腺炎中的分子作用机制研究

徐秋芳  
【摘要】: 目的: 研究宿主蛋白GM130(Golgi matrix protein 130)在B3型柯萨奇病毒(Coxsackievirus B3,CVB3)致BALB/c成年小鼠胰腺炎中的分子作用机制,为CVB3致病机制及抗病毒药物的研究奠定基础。 方法: 1. 106 PFU CVB3经腹腔注射感染BALB/c成年小鼠,采用脏器指数测定和组织病理学方法(苏木精-伊红染色),于病毒感染后0天、3天、6天和9天检测胰腺和心肌组织的病理变化; 2.收集病毒感染0天、3天、6天和9天的BALB/c小鼠胰腺和心脏组织蛋白,采用Western Blotting检测病毒感染后BALB/c成年小鼠胰腺和心脏中GM130和VP1蛋白的表达变化,以分析CVB3在不同组织中的增殖情况以及其对宿主蛋白GM130的影响; 3.以正常BALB/c成年小鼠和新生小鼠为研究对象,运用Western Blotting和组织免疫荧光分析GM130在BALB/c小鼠胰腺和心脏中的分布情况; 4.取病毒感染0天、3天、6天和9天的BALB/c成年小鼠胰腺组织,制作石蜡和冰冻切片,运用组织免疫化学和组织免疫荧光检测病毒感染后胰腺组织中GM130的形态变化情况,以分析CVB3对动物细胞高尔基体的影响; 5.用MOI=5的CVB3感染Hela细胞后,运用细胞内免疫共沉淀技术和激光共聚焦定位分析检测病毒蛋白VP1、细胞蛋白GM130以及GRASP65(Golgi Reassembly Stacking Protein 65)的相互作用,分析病毒蛋白VP1和宿主蛋白GM130相互作用对细胞高尔基体的影响。 结果: 1.脏器指数和HE染色结果综合显示:自病毒感染后,胰腺组织中炎症细胞浸润逐渐增多,胰腺腺泡结构被破坏,引起了严重的胰腺炎;而心肌组织中只见有少量的炎症细胞浸润,心肌结构未见明显异常,病损较轻; 2. Western Blotting结果显示CVB3感染BALB/c成年小鼠后,病毒在胰腺组织中大量增殖,而宿主蛋白GM130的表达下调; 3. Western Blotting和组织免疫荧光结果显示正常BALB/c小鼠中GM130的表达有差异:成年小鼠的胰腺和新生小鼠的心脏中GM130高表达,而成年小鼠的心脏和新生小鼠的胰腺中未检测到GM130; 4.动物实验结果显示正常胰腺组织中GM130呈环状,紧密而连续地分布于核周,自病毒感染后,环状结构被破坏,随着感染时间的延长,GM130渐渐弥散、消失; 5.免疫共沉淀和激光共聚焦定位分析证实CVB3结构蛋白VP1和细胞蛋白GM130之间有直接相互作用,而且VP1-GM130的相互作用干扰了Hela细胞中GM130与GRASP65的相互作用,进而破坏了高尔基带的结构。 结论: 1.宿主蛋白GM130是一个组织依赖性和年龄依赖性的CVB3病毒靶蛋白; 2. CVB3病毒蛋白VP1和宿主细胞蛋白GM130的直接相互作用导致GM130-GRASP65复合体的破坏,并影响GM130与GRASP65的表达和空间分布,进而引起高尔基带的断裂,最终损伤高尔基体功能。这可能是CVB3引起BALB/c成年小鼠病毒性胰腺炎的机制之一。


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