吲哚胺2，3双加氧酶在胃癌免疫中作用的初步研究

【摘要】：目的： 研究胃癌组织中吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)的表达情况和CDllc+树突状细胞(CD11c+DC)的分布情况,探讨胃癌组织中IDO的表达、CD11c+DC的分布与患者临床病理特征的关系及其对预后的指导意义。构建IDO真核表达载体pIRES2-EGFP-IDO,转染树突状细胞(IDO-DC),考察体外IDO-DC对异体反应性T细胞增殖的影响。 方法： 1选取2001年1月至2007年6月天津医科大学附属肿瘤医院65例手术治疗胃癌患者的组织蜡块,免疫组织化学法检测IDO的表达情况、CD11c+DC的分布情况,观察IDO的表达、CD11c+DC的分布与临床病理特征的关系及其对预后的指导意义。 2钓取IDO基因编码序列(CDS)区域,克隆至pMD 19-T simple载体中,测序验证后连入真核表达载体pIRES-EGFP,构建pIRES-EGFP-IDO重组质粒。将IDO真核表达载体pIRES-EGFP-IDO电转染至胃癌患者外周血单核细胞来源DC,构建表达IDO的DC,RT-PCR检测IDO基因的mRNA的表达,Western blot检测IDO基因的表达,氨基酸分析仪测定IDO蛋白的酶活性。 3分选并纯化异体胃癌患者外周血CD3+T细胞,将其与IDO-DC共孵育,以转染空质粒组和未进行转染的DC为对照。检测体外IDO对异体反应性T细胞增殖的影响。 结果： 1免疫组化结果显示：胃癌组织和正常胃黏膜组织中IDO阳性表达率分别为47.7%(31/65)和22.7%(5/22),统计学分析显示,胃癌组织中IDO阳性表达率显著高于正常胃黏膜组织(X2=4.223,P=0.040)。胃癌组织中IDO的表达与胃癌患者的TNM分期、肿瘤直径、病理类型及淋巴结转移具有显著正相关。 2免疫组化结果显示：胃癌组织中CD11c+DC浸润的数量为23.28±10.34,正常胃黏膜组织中CD11c+DC浸润的数量为28.75±5.78,统计学分析显示,胃癌组织中CD11c+DC的数量显著低于正常胃黏膜组织(t=2.568,P=0.043)。胃癌组织中CD11c+DC的数量与胃癌患者的TNM分期、病理类型及淋巴结转移具有显著负相关。 3预后分析显示,淋巴结转移、TNM分期、肿瘤直径、T分期、CD11c+DC数量和IDO的表达情况是胃癌患者预后的影响因素。进一步多因素分析显示,TNM分期和IDO的表达情况是胃癌患者预后的独立影响因素。 4检测未转染DC、转染空质粒组和IDO-DC组的IDO mRNA的表达,IDO/β-actin灰度值之比分别为(0.1183+0.0602)、(0.1190±0.0547)和(0.5627±0.1414), IDO-DC组灰度值明显高于另外两组(F=29.638, P0.001). Western blot检测IDO-DC中IDO蛋白的表达情况,可检测到相对分子量约为42KD的蛋白质,提示外源性IDO基因在IDO-DC成功表达。在IDO-DC组和未转染DC组的细胞培养上清液中色氨酸(Trp)浓度分别为(3.23±0.53)mg/L和(6.03+0.51)mg/L,差异有统计学意义(t=13.32,P0.001)；犬尿氨酸(Kyn)浓度分别为(4.84±0.11)mg/L和(1.83±0.10)mg/L,差异有统计学意义(t=42.916,P0.001),提示IDO-DC表达的IDO具有完整的酶活性。 5未转染组、转染空质粒组及IDO-DC组对异体反应性T细胞增殖影响的差异具统计学意义(F=4.595,P=0.042)。与转染空质粒、DC组比铰IDO-DC对异体反应性T细胞具有明显抑制活性(P0.05) 结论： 1胃癌组织中IDO的表达显著高于正常胃黏膜组织.胃癌组织中CD11c+DC的数量显著低于正常胃黏膜组织。胃癌组织中IDO的表达水平与TNM分期、病理类型、肿瘤直径、淋巴结转移具有相关性；CD11c+DC的分布与TNM分期、病理类型、淋巴结转移具有相关性,提示胃癌组织中IDO、CD11c+DC可能参与胃癌的进展、转移过程。 2胃癌微环境中的IDO的表达水平是独立预后影响因素,可作为判断患者预后的指标。 3成功构建了IDO重组真核表达载体pIRES-EGFP-IDO,并成功转染了DC。IDO的活性表达可导致微环境中色氨酸耗竭,并产生其分解代谢产物,如犬尿氨酸等衍生物。 4体外实验证实DC上IDO可以抑制异体反应性T淋巴细胞的增殖过程,这提示IDO可能通过抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖,从而影响了机体局部免疫反应。