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胰腺癌细胞乏氧环境下Kit配基的表达调控机制及功能研究

高春涛  
【摘要】:目的:胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤,目前手术、放、化疗治疗胰腺癌的效果并不理想。乏氧是胰腺癌组织常见的生长微环境,胰腺癌细胞如何耐受乏氧环境,在乏氧环境中获得生长优势,机制尚未阐明。Kit配基(Kit ligand, KL),即steel因子,肥大细胞生长因子,干细胞因子。Kit配基过表达于多种肿瘤细胞,如胃肠间质肿瘤、小细胞肺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌等。KL特异性配基为c-kit,表达于造血干细胞、肥大细胞、生殖细胞和多种肿瘤细胞表面。KL结合c-kit后,引起后者二聚化,通过不同信号传导通路,引起多种生物学效应。Kit配基除了参与造血、胚胎发育等生理活动外,还与多种肿瘤的恶化、转移密切相关。先前的研究表明,乏氧微环境可以诱导Kit配基的表达,Kit配基是促进肿瘤增殖和血管新生的重要因子,也可能是参与胰腺癌代偿乏氧环境的重要因子。本研究旨在探讨Kit配基在胰腺癌乏氧环境中表达的病生理意义及转录调控机制。 方法:比较在常氧和乏氧状态下,胰腺癌细胞BxPC-3中KL的表达情况,采用Western blot方法检测KL蛋白表达水平,采用real-time PCR法检测KL mRNA表达水平,从而明确KL参与肿瘤细胞乏氧过程的调控;通过RNA干扰技术分别下调胰腺癌细胞中HIF-1的表达后,检测KL蛋白及mRNA表达水平的变化;进一步采用染色体免疫共沉淀技术CChIP)明确HIF-1是直接调控KL表达,还是间接通过其他转录因子调控KL表达;进而探讨HIF是否参与对KL基因转录的上调表达,构建HIF-1的过表达载体及不同长度的KL基因启动子荧光素酶表达载体,共同转染胰腺癌细胞,采用双荧光素酶分析法,定量检测HIF过表达前后KL基因启动子荧光素酶表达水平;接下来应用Edu MTT、Transwell实验检查HIF与Kit配基对胰腺癌BxPC-3细胞的增殖、迁移及侵袭情况;最后采用免疫组化染色分析胰腺癌组织中KL、HIF-1表达之间的相关性,验证组织中HIF对KL的调控关系,并通过对随诊资料的分析,探讨HIF-1及KL表达水平对胰腺癌预后的影响。 结果:Western blot分析结果显示,BxPC-3细胞在常氧条件下即表达低水平的Kit配基,经过乏氧培养后,Kit配基的蛋白表达水平显著升高。作为调节乏氧相关基因的转录因子,HIF-1在乏氧状态下亦显著升高;Real-time PCR的方法分析相关基因的转录表达情况。乏氧情况下Kit配基的表达水平明显增加,与此同时,HIF-1分子的mRNA表达与Kit配基的上调,显示出一定同步性;转染siRNA并乏氧刺激后通过Western blot分析胰腺癌细胞BxPC-3中HIF-1α/Kit配基的蛋白表达较乏氧对照表达均下调,提示干扰HIF-1α对Kit配基有明显的调节作用。 染色体免疫共沉淀分析(ChIP)发现HIF-1可以结合于Kit配基的基因启动子区,而在常氧条件下,未检测出HIF-1与Kit配基的结合。将HIF-1过表达载体或者空载体和构建的Kit配基基因启动子区的荧光素酶表达载体共转染入BxPC-3细胞,过表达HIF-1相对于转染空载体组,Kit配基全长基因启动子转录活性明显增加,提示我们HIF-1不仅结合于Kit配基的基因启动子区,而且可以上调其表达。 应用流式细胞仪检测BxPC-3细胞证实其c-kit表达,应用不同浓度的Kit配基蛋白,施加外源刺激,发现随着Kit配基浓度的增加,BxPC-3的增殖作用越旺盛。应用Kit配基的中和抗体,施加于乏氧环境下的BxPC-3细胞,可以抑制其增殖作用。应用MTT试验,我们也观察到了相似的结果。Transwell实验发现加入KL的培养液对细胞具有趋化及促迁移的作用,而这种作用能为抗KL的抗体所阻断。 收集95例胰腺癌病人的组织学标本,针对HIF-1和Kit配基的免疫组织化学染色。结果显示:HIF-1α蛋白及Kit配基均定位于细胞浆和细胞核,棕黄色颗粒状弥漫分布,胰腺癌组织高表达HIF-1和Kit配基,胰腺癌癌旁组织及正常胰腺组织均不表达或Kit配基的表达水平较低。Spearman's相关分析,HIF-1和Kit配基在胰腺癌组织中的表达呈正相关。HIF-1和Kit配基的表达和胰腺癌的肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期密切相关,而与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度关系不明显。患者预后生存分析结果显示,HIF-1和KL表达水平与胰腺癌患者预后密切相关。 结论:综上所述:Kit配基是促进胰腺癌增殖和侵袭的重要细胞因子;乏氧环境下HIF-1是调节Kit配基表达的关键转录因子;通过干预HIF-1和Kit配基信号通路,有可能成为治疗胰腺癌的潜在靶点。


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