来曲唑治疗大鼠子宫内膜异位症模型的实验研究

【摘要】：子宫内膜异位症(endometriosis, EMs,简称内异症)是导致生育期妇女痛经、不孕、慢性盆腔痛等的常见疾病,近年来发病率有逐年增高趋势。生育期妇女的发病率达10%-15%。该病虽是一种良性疾病,但却有侵袭、转移、复发等恶性生物学行为。至今发病机制不清,治疗效果不佳,复发率高,严重影响着患者的健康和生活质量。子宫内膜异位症成为妇科领域的治疗难点和热点问题。 内异症是一种雌激素依赖性疾病,雌激素的合成代谢在内异症疾病的发生、发展中占有重要的地位。细胞色素芳香化酶P450(AromataseP450,P450arom)是雌激素合成的限速酶,可催化雄烯二酮(A)和睾酮(T)转变生成雌酮(E1)和雌二醇(E2)。内异症在位内膜与异位病灶中都已证实能检测到P450arom mRNA的转录及蛋白的表达,而在正常子宫内膜中无P450arommRNA的转录和P450arom的表达。 在内异症中,除了雌激素的内分泌机制外还存在雌激素的旁分泌或胞分泌机制即：在异位内膜细胞的胞质中可合成雌激素,并直接作用于同一细胞或其周边细胞的胞核受体发挥作用,而且,在异位病灶局部存在前列腺素-芳香化酶-雌激素之间的正反馈循环,促进异位子宫内膜雌激素的合成,使得局部雌激素水平持续增高,从而加速内异症的病理进程。以GNRHa为代表的现有治疗药物主要是通过抑制卵巢合成雌激素来发挥作用,而不能抑制异位灶自身雌激素的生成。而芳香化酶抑制剂能抑制卵巢及卵巢外组织(包括皮肤、脂肪、肾上腺及异位灶局部)芳香化酶的活性,从而有效地抑制雌激素生成。这为芳香化酶抑制剂治疗子宫内膜异位症提供了理论基础。 芳香化酶抑制剂是治疗内异症的一种新方法。研究表明芳香化酶抑制剂对绝经后进展、复发的内异症有明显疗效,但绝大部分EMs为绝经前患者,芳香化酶主要存在于芳香化酶底物含量非常高的卵巢组织中,有学者认为血清雌激素降低会通过负反馈使LH和FSH分泌增加,LH会刺激卵巢产生更多的雄烯二酮作为芳香化酶的底物,FSH则会扩增芳香化酶的含量从而会降低芳香化酶抑制剂的治疗作用,并会引起卵巢过度刺激,因此,应同时加用抑制卵巢功能的药物。但也有观点认为即使在有LH和FSH负反馈升高的情况下,芳香化酶抑制剂仍可有效降低血清雌激素水平,从而有效治疗内异症。芳香化酶抑制剂对绝经前子宫内膜异位症的治疗效果、作用机制及合理有效的治疗方案仍有待研究。 本研究成功建立了大鼠子宫内膜异位症模型,通过检测大鼠子宫内膜异位症模型治疗前后异位病灶体积的变化,异位内膜病灶中芳香化酶mRNA的表达及芳香化酶、环氧合酶-2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)基因的蛋白表达,异位内膜细胞凋亡情况,大鼠血清FSH、LH、E2水平及一侧子宫角和卵巢质量及形态学变化,探讨第三代芳香化酶抑制剂来曲唑单用及联合醋酸甲孕酮对大鼠子宫内膜异位症模型的治疗效果、作用机制及对生殖系统的影响,为临床治疗绝经前EMs提供合理的治疗方案及实验依据。论文分为大鼠子宫内膜异位症模型的建立及来曲唑单用与联合醋酸甲孕酮治疗大鼠子宫内膜异位症模型的实验研究两部分,对相关内容进行阐述。 一、大鼠子宫内膜异位症模型的建立 目的：用子宫内膜自体移植方法构建SD大鼠子宫内膜异位症模型,为进一步实验奠定基础。 方法：65只性成熟未孕雌性SD大鼠,通过观察阴道脱落细胞形态学变化,监测大鼠动情周期,选择有2个以上连续动情周期的大鼠,在第三个动情期,参照Jones的子宫内膜自体移植方法,以大鼠腹壁作为移植部位,将5mmm×5mm大小的自体子宫内膜组织片缝至大鼠侧腹壁上,建立大鼠子宫内膜异位症模型。建模4周后第二次开腹观察异位病灶形成情况、外观形态,用游标卡尺测量异位灶的长、宽、高,计算病灶体积。将建模成功大鼠随机分成5组,作为第二部分实验的对象。建模7周后即分组治疗3周后,第三次开腹检查异位病灶的形态及体积,并取移植物做病理组织学观察。 结果：1.实验大鼠均有规律连续的动情周期,动情周期为4-5天。阴道涂片观察动情周期分为4期：动情前期见大量有核上皮细胞,偶有少量角化上皮细胞；动情期为大量无核角化上皮细胞,间有少量上皮细胞；动情后期主要是大量白细胞,也有少量融合的角化上皮细胞；动情间期见大量的多形核白细胞,及少量有核上皮细胞。 2.建模4周后第二次开腹检查,65只大鼠中共有50只大鼠有子宫内膜异位病灶形成,造模成功率为76.92%(50/65)。移植成功的异位病灶外观表现为透明的囊泡,内有清亮或淡黄色液体积聚,表面血管清晰可见。异位病灶结构清晰,与周围组织无粘连。病理检查证实移植物中均有子宫内膜上皮细胞、腺体和间质生长。 3.建模7周后第三次开腹观察,对照组异位内膜生长良好,异位病灶的大小、形态均无明显变化(P0.05),说明模型性质稳定、可靠。 结论：采用子宫内膜自体移植法在动情期建立大鼠腹壁子宫内膜异位症模型经济、简便、有效、可靠,为子宫内膜异位症的药物治疗研究提供了有利的动物模型。 二、来曲唑单用与联合醋酸甲孕酮治疗大鼠子宫内膜异位症模型的实验研究 目的：通过检测大鼠子宫内膜异位症模型治疗前后异位病灶体积的变化,异位内膜病灶中芳香化酶mRNA及芳香化酶(P450arom)、环氧合酶-2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达,异位内膜细胞凋亡情况,大鼠血清FSH、LH、E2水平及一侧子宫角和卵巢质量及形态学变化,探讨来曲唑单用及联合醋酸甲孕酮对大鼠子宫内膜异位症模型的治疗效果、作用机制及对生殖系统的影响。 方法：将50只建模成功大鼠随机分为5组(n=10)：A组(来曲唑组)：给予来曲唑1mg/kg/d灌胃×3W；B组(醋酸甲孕酮组)：给予醋酸甲孕酮8mg/kg/d灌胃×3W；C组(联合组)：给予来曲唑1 mg/kg/d醋酸甲孕酮8mg/kg/d灌胃×3W；D组(去势组)：于造模后第4周开腹同时切除双侧卵巢,观察3周；E组(对照组)：每日给予等量生理盐水灌胃×3W。分组处理3周后,第三次开腹,用游标卡尺测量异位病灶的长、宽、高,计算体积,比较治疗前后EMs大鼠异位病灶体积的变化；原位杂交法检测异位内膜中P450arom mRNA的表达；免疫组化SP法检测异位内膜病灶中P450arom、COX-2、VEGF、PCNA蛋白的表达；末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况；放射免疫分析法测定大鼠血清FSH、LH、E2水平；另取对侧子宫角及卵巢,称重后行HE染色,观察形态学变化。 结果：1.治疗前各组异位病灶体积无差异(P0.05)。治疗3周后,来曲唑组、醋酸甲孕酮组、联合组及去势组异位病灶体积均明显缩小(P0.01),以联合组和去势组体积缩小最为显著(P0.01)。 2.来曲唑组、联合组及去势组异位内膜中P450arommRNA及P450arom、COX-2、VEGF、PCNA蛋白表达与对照组相比均明显降低(P0.05),醋酸甲孕酮组的异位内膜VEGF、PCNA蛋白表达降低(P0.05),而P450arommRNA及P450arom、COX-2蛋白表达与对照组相比无明显差异(P0.05) 3.来曲唑组、醋酸甲孕酮组、联合组及去势组较对照组异位内膜细胞凋亡率明显增加(P0.01),以联合组凋亡率最高(P0.05)。 4.醋酸甲孕酮组及联合组大鼠血清FSH、LH、E2水平均比对照组明显降低(P0.05),而且联合组E2水平更低(P0.05)达到去势组水平(P0.05),来曲唑组大鼠血清FSH、LH、E2水平与对照组相比无明显差异(P0.05)。 5.来曲唑组大鼠卵巢质量明显增加(P0.01),卵巢呈多囊改变；醋酸甲孕酮组及联合组卵巢质量与对照组相比无明显差异(P0.05),卵巢呈功能抑制状态。 6.来曲唑组、醋酸甲孕酮组、联合组及去势组子宫质量均对照组均减轻(P0.05),内膜均呈增生抑制或萎缩改变。 结论：1.来曲唑单用对子宫内膜异位症模型大鼠有治疗作用,但会引起模型大鼠卵巢过度刺激导致卵巢质量增加、卵巢呈多囊样改变。 2.来曲唑联合醋酸甲孕酮治疗大鼠子宫内膜异位症模型比来曲唑或醋酸甲孕酮单用更有效,且避免了来曲唑单用引起的卵巢过度刺激。 3.来曲唑和醋酸甲孕酮通过协同作用降低大鼠血清E2水平并减少异位内膜局部雌激素和前列腺素分泌,减少局部血管生成及抑制异位内膜增殖并促进凋亡来治疗子宫内膜异位症。 4.来曲唑联合醋酸甲孕酮对生殖系统的影响应引起重视。